Amesův test je biologický test k posouzení mutagenního potenciálu chemických sloučenin. Využívá bakterie k testování, zda daná chemická látka může způsobit mutace v DNA testovaného organismu. Test vyvinul Bruce N. Ames v 70. letech 20. století, aby zjistil, zda je daná chemická látka mutagenní.
Cíl
Zjistit mutagenní aktivitu chemických látek pozorováním, zda způsobují mutace ve vzorku bakterií.
Princip
- Amesův test využívá několik kmenů bakterií (Salmonella, E.coli), které jsou nositeli určité mutace.
- Bodové mutace se provádějí v histidinovém (Salmonella typhimurium) nebo tryptofanovém (Escherichia coli) operonu, čímž se bakterie stávají neschopnými produkovat odpovídající aminokyselinu.
- Tyto mutace vedou k his- nebo trp- organismům, které nemohou růst, pokud jim není dodáván histidin nebo tryptofan.
- Kultivace His- salmonel v médiu obsahujícím určité chemické látky však způsobí mutaci genu kódujícího histidin tak, že znovu získají schopnost syntetizovat histidin (His+). To znamená, že když dojde k mutagenní události, záměny bází nebo posuny rámců v genu mohou způsobit návrat k prototrofii aminokyselin. Jedná se o reverzní mutaci.
- Tyto revertované bakterie pak porostou v médiu s nedostatkem histidinu, respektive tryptofanu.
Mutagenní potenciál vzorku se posuzuje tak, že se organismy vyžadující aminokyseliny vystaví různým koncentracím chemické látky a provede se výběr reverzní události. Pro tuto selekci se používají média s nedostatkem specifické aminokyseliny, která umožňují přežití a růst pouze těm buňkám, které prošly reverzí k histidinové / tryptofanové prototrofii. Pokud testovaný vzorek tuto reverzi způsobí, jedná se o mutagen.
Metoda
I ) Izolujte auxotrofní kmen Salmonella Typhimurium na histidin. (tj. His-ve)
II) Připravte zkušební suspenzi His-ve Salmonella Typhimurium v prostém pufru se zkušební chemikálií (např. 2-aminofluorenem). Přidejte také malé množství histidinu.
Poznámka: malé množství histidinu je nutné, aby bakterie začala růst. Po vyčerpání histidinu tvoří kolonie pouze bakterie zmutované tak, aby získaly schopnost syntetizovat histidin.
III) Připravte také kontrolní suspenzi His-ve Salmonella Typhimurium, ale bez testovaných chemických látek.
IV) Inkubujte suspenze při 37 °C po dobu 20 minut
V) Připravte si dvě agarové desky a rozetřete suspenzi na agarovou desku.
VI) Inkubujte desky při 37 °C po dobu 48 hodin.
VII) Po48 hodinách spočítejte počet kolonií na každé destičce.
Interpretace výsledků
- Mutagenita chemických látek je úměrná počtu pozorovaných kolonií.
- Pokud je na zkušební destičce velký počet kolonií ve srovnání s kontrolou, pak se o takové chemické látce říká, že je mutagenní.
- Velmi malý počet kolonií lze pozorovat i na kontrolní destičce. To může být způsobeno spontánní bodovou mutací na genu kódujícím hisidin.
Použití
Ačkoli se Amesův test používá k identifikaci reverzních mutací, které jsou přítomny v kmenech, lze jej také použít ke zjištění mutagenity vzorků z životního prostředí, jako jsou léky, barviva, činidla, kosmetika, odpadní voda, pesticidy a další látky, které se snadno rozpouštějí v kapalné suspenzi.
Přednosti
- Jednoduchý, rychlý a robustní bakteriální test.
- Snadnost a nízká cena testu jej činí neocenitelným pro screening látek v našem životním prostředí na možnou karcinogenitu.
- Ames test dokáže detekovat vhodné mutanty ve velké populaci bakterií s vysokou citlivostí.
Omezení
- Některé látky, které způsobují rakovinu u laboratorních zvířat (například dioxin), nedávají pozitivní výsledek Amesova testu (a naopak)
- Amesův test se skládá z kmenů Salmonella typhimurium, a proto není dokonalým modelem pro člověka.
.