Obsah přednášky
Úvod
Sekreční dráha v eukaryotických buňkách slouží k posílání proteinů a lipidů do plazmatické membrány a některých organel vázaných na membránu a k uvolňování materiálu mimo buňku. Existují dva typy sekrece: konstitutivní a regulovaná. Konstitutivní sekrece je výchozí cestou a slouží především k doplňování materiálu na plazmatické membráně a některých membránových organelách. Regulovaná sekrece končí v sekrečních vezikulách, které uchovávají vylučovaný materiál, dokud signál nespustí fúzi s plazmatickou membránou. Oba typy sekrece využívají stejnou dráhu, ale signální sekvence přesměrovávají proteiny do regulované dráhy. Buňky také získávají materiál z plazmatické membrány prostřednictvím endocytózy. Tento materiál může být buď recyklován do plazmatické membrány, nebo rozložen v lysozomu.
Principy sekreční dráhy
Proteiny a lipidy jsou syntetizovány v ER a poté transportovány do Golgiho. Proteiny jsou v Golgiho dráze tříděny a posílány do plazmatické membrány, lysozomu nebo sekrečních vezikul. Transport proteinů a lipidů mezi membránovými kompartmenty je zprostředkován vezikulami, které vznikají z jednoho kompartmentu a poté se spojují s následujícím kompartmentem. Raby, tethery a SNARE zvyšují pravděpodobnost, že se vezikuly spojí se správnou cílovou membránou. Buňky udržují integritu a funkčnost ER a Golgiho membrán tím, že brání rezidentním proteinům ve vstupu do vezikul a získávají zpět ty proteiny, které uniknou.
Glykosylace
Glykosylace je kovalentní připojování cukrů k proteinům, ke kterému dochází u většiny proteinů v ER. Glykosylace napomáhá skládání proteinů, zaměřuje proteiny na specifické organely (např. lysozom) a inhibuje proteolýzu. Kromě toho je mnoho proteinů na povrchu buněk a v extracelulární matrix, která buňky obklopuje, silně glykosylováno pro různé biologické účely.
N-vázaná glykosylace probíhá v ER a zahrnuje přidání skupiny 14 cukrů k aminoskupině asparaginů. Tyto skupiny obsahují směs N-acetylglukosaminu, manózy a glukózy. Glukózové zbytky jsou odstraněny v ER před transportem proteinu do Golgiho. V Golgi mohou být postranní řetězce cukrů dále modifikovány odstraněním a přidáním různých cukrů.
O-vázaná glykosylace je druhou formou a zahrnuje přidání cukrů k serinům nebo treoninům. O-vázaná glykosylace pravděpodobně začíná v Golgiho centru přidáním jediného cukru. Jiné enzymy přidávají cukry ve skupinách po dvou a postranní řetězce cukrů mohou být extrémně dlouhé.
Golgiho komplex je hromada membránových cisteren s jedinečným biochemickým složením. Cisterny se obvykle označují jako cis, mediální, trans a trans-Golgiho síť, přičemž bílkoviny vstupují do cis z ER a vystupují z TGN. Zdá se, že cisterny obsahují jedinečnou sadu enzymů, které upravují postranní řetězce cukrů na bílkovinách. Například manóza se odstraňuje především v mediální cisterně, zatímco galaktóza se přidává v trans cisterně.
Vesikulární transport
Přenos mezi membránovými oddíly zprostředkovávají malé vezikuly. Vezikuly obsahují proteinový obal, který řídí tvorbu vezikul a rekrutuje proteiny do vezikul. Vezikuly jsou zaměřeny do správného kompartmentu kombinací proteinů Rab a SNARE. Rab jsou velkou rodinou malých proteinů vážících GTP a zdá se, že každý membránový kompartment v sekreční dráze obsahuje jedinečný protein Rab. SNARE jsou proteiny na vezikulech a membránových kompartmentech, které se párují a zprostředkovávají fúzi. SNARE tvoří další velkou rodinu proteinů a různé kompartmenty pravděpodobně obsahují jedinečné proteiny SNARE.
Tvorba vezikul
Tvorba vezikul z ER je nejjasněji pochopena a bude sloužit jako příklad toho, jak se vezikuly tvoří. Mechanismus je pravděpodobně podobný i u jiných kompartmentů. Tvorbu řídí sestavení bílkovinného pláště a sestavení pláště začíná navázáním malého GTP-vázajícího proteinu Sar1. Sar1-GTP se spojí s ER a vloží malou šroubovici do vnějšího listu dvojvrstvy membrány ER, čímž zahájí zakřivení membrány. Sar1-GTP rekrutuje dvě další sady proteinů, které tvoří obal vezikul: komplex Sec23-Sec24, který se váže na nákladové proteiny, a komplex Sec13-Sec31, který pomáhá řídit tvorbu vezikul. Výběr nákladu pro většinu proteinů vyžaduje signální sekvenci, která interaguje s komplexem Sec23-24. Rozpustné proteiny v lumen ER se spojují s cargo receptory, které obsahují signální sekvenci, jež váže Sec23-Sec24. Obalový komplex, který obklopuje vezikuly z ER, se nazývá COP II.
Targeting Vesicles to Correct Compartment
Zdá se, že dvě sady proteinů pomáhají vezikulám spojit se se správnou cílovou membránou. Jedna sada zahrnuje tethery, které se lokalizují do cílových membránových kompartmentů a interagují se složkami obalu vezikul. V buňkách bylo identifikováno několik různých teterů a zdá se, že každý z nich je lokalizován v jiném kompartmentu. Tethery vytvářejí struktury, které vystupují z membrány kompartmentu do cytosolu. To může teterům pomoci interagovat s vezikuly přicházejícími z předchozího membránového kompartmentu.
Druhou sadou proteinů, která pomáhá správně nasměrovat vezikuly do příslušné membrány, jsou SNARE. SNARE také zprostředkovávají fúzi mezi membránami. Vezikuly obsahují jeden protein SNARE (vSNARE) a membránové kompartmenty obsahují 2 až 3 proteiny SNARE (tSNARE). Proteiny SNARE na vezikulech a membránových kompartmentech interagují specificky. Živočišné buňky exprimují 35 různých proteinů SNARE, ale pouze určité sady SNARE spolu interagují. Lokalizací těch SNARE, které interagují pouze na vezikuly a jejich cílovou membránu, buňky zajišťují, že se vezikuly spojí se správnou cílovou membránou.
Membránová fúze
Proteiny SNARE zprostředkovávají fúzi mezi vezikuly a jejich cílovým membránovým kompartmentem. Proteiny SNARE obsahují dlouhé oblasti, které tvoří šroubovicové struktury. Šroubovicové domény u vSNARE a tSNARE spolu interagují a zřejmě se zapínají. Předpokládá se, že energie uvolněná úplným spárováním vSNARE a tSNARE pohání fúzi mezi membránou vezikul a membránou kompartmentu, ačkoli přesný mechanismus zůstává nejasný.
Některé vezikuly se na cílové membráně zakotví, ale nedojde k jejich fúzi. Například sekreční vezikuly uchovávají proteiny a další malé molekuly, dokud buňka nedostane signál k jejich uvolnění. Některé sekreční vezikuly se připojují k plazmatické membráně prostřednictvím interakce vSNARE a tSNARE, ale SNARE se nemohou zcela spárovat, aby došlo k fúzi membrán. Vnější signály spustí odstranění inhibice párování a umožní vezikulám splynout s plazmatickou membránou.
Třídění proteinů v trans-Golgiho síti
Po dosažení trans-Golgiho sítě je většina proteinů zaměřena na své konečné místo určení. Zdá se, že výchozí cestou je transport do plazmatické membrány, protože plazmatická membrána potřebuje průběžně vyměňovat lipidy a proteiny. Ostatní proteiny jsou tříděny do lysozomů a sekrečních vezikul. Signál pro odeslání proteinu do lysozomu zahrnuje postranní řetězec cukru. Většina lysozomálních proteinů obsahuje mannosa-6-fosfát, který se přidává v cis-Golgi. Receptor, který váže mannosa-6-fosfát, se nachází v trans-Golgiho síti a rekrutuje obalové proteiny do trans-Golgiho sítě. Clathrin vytváří plášť kolem těchto vezikul a vezikuly před vypuzením ze sítě trans-Golgiho hromadí lysozomální proteiny. Tyto vezikuly se spojí s endosomy. Lumen endosomů má nízké pH, což způsobuje disociaci mannosa-6-fosfátového receptoru od lysosomálních proteinů. Mannosa-6-fosfátový receptor se vrací do trans-Golgiho sítě a vezikuly obsahující lysozomální proteiny dozrávají ve funkční lysozom.
Některé proteiny jsou tříděny do sekrečních vezikul, které tyto proteiny uchovávají, dokud buňka nedostane signál k jejich uvolnění. Mechanismus, kterým jsou proteiny tříděny do sekrečních vezikul, protože tyto proteiny nemají společnou třídicí signální sekvenci.
Endocytóza
Buňky nejen uvolňují materiál do vnějšího prostředí, ale také přijímají materiál z vnějšku plazmatické membrány prostřednictvím endocytózy. Existuje několik forem endocytózy.
Fagocytóza umožňuje některým buňkám (makrofágy, neutrofily) pohlcovat a přijímat velké částice, jako jsou mikroorganismy a mrtvé buňky. Fagocytóza zahrnuje vysunutí plazmatické membrány kolem částice. Vysunutí je poháněno polymerizací aktinu. Plazmatická membrána nakonec částici obklopí a splyne, čímž ji zcela uzavře a vytvoří velký endocytární vezikul.
Pinocytóza vytváří mnohem menší vezikuly (~ 100 nm) a umožňuje buňkám přijímat malá množství extracelulární tekutiny a části plazmatické membrány. Jednou z forem pinocytózy je klatrinem zprostředkovaná endocytóza, která umožňuje buňkám přijímat specifické proteiny z povrchu buňky.
Klatrinem zprostředkovaná endocytóza začíná vytvořením jamky v plazmatické membráně. Pit je na cytoplazmatické straně obklopen adaptorovými proteiny, které spojují klathrin s pitem. Adaptory také interagují s proteiny v plazmatické membráně, které jsou určeny pro endocytózu. Jáma může pojmout ~ 1000 proteinů. Polymerizace klathrinu vede k vytvoření vezikuly, která se nakonec oddělí od plazmatické membrány. GTPáza dynamin katalyzuje reakci odštěpení. Vezikuly obalené klathrinem se spojí s endosomy, kde nízké pH disociuje ligandy od receptorů. Některé proteiny se pak vracejí zpět do plazmatické membrány, zatímco jiné jsou směrovány do lysozomu, kde jsou degradovány.
.