Jedním z přístupů k prevenci PD je fyzikálně-chemická optimalizace PCR systému, tj. změna koncentrace primerů, chloridu hořečnatého, nukleotidů, iontové síly a teploty reakce. Tato metoda je poněkud omezena fyzikálně-chemickými vlastnostmi, které rovněž určují účinnost amplifikace cílové sekvence v PCR. Snížení tvorby PDs proto může vést také ke snížení účinnosti PCR. K překonání tohoto omezení slouží jiné metody zaměřené pouze na snížení tvorby PDs, včetně návrhu primerů a použití různých enzymových systémů nebo činidel pro PCR.
Software pro návrh primerůUpravit
Software pro návrh primerů používá algoritmy, které kontrolují možnost tvorby sekundární struktury DNA a žíhání primerů k sobě nebo v rámci párů primerů. Fyzikální parametry, které software bere v úvahu, jsou potenciální vzájemná komplementarita a obsah GC primerů; podobné teploty tání primerů a nepřítomnost sekundárních struktur, jako jsou kmenové smyčky, v cílové sekvenci DNA.
PCREdit
Protože jsou primery navrženy tak, aby měly nízkou vzájemnou komplementaritu, mohou se annealovat (krok I na obrázku) pouze při nízké teplotě, např. při pokojové teplotě, například během přípravy reakční směsi. Ačkoli DNA polymerázy používané při PCR jsou nejaktivnější při teplotě kolem 70 °C, mají určitou polymerační aktivitu i při nižších teplotách, což může způsobit syntézu DNA z primerů po jejich vzájemném žíhání. Bylo vyvinuto několik metod, jak zabránit tvorbě PD, dokud reakce nedosáhne pracovní teploty (60-70 °C), a ty zahrnují počáteční inhibici DNA polymerázy nebo fyzické oddělení reakčních složek reakce, dokud reakční směs nedosáhne vyšších teplot. Tyto metody se označují jako PCR s horkým startem.
Vosk: při této metodě je enzym prostorově oddělen od reakční směsi voskem, který se roztaví, když reakce dosáhne vysoké teploty.
Pomalé uvolňování hořčíku: DNA polymeráza potřebuje ke své činnosti ionty hořčíku, takže hořčík je chemicky oddělen od reakce vazbou na chemickou sloučeninu a do roztoku se uvolňuje až při vysoké teplotě
Nekovalentní vazba inhibitoru: při této metodě se peptid, protilátka nebo aptamer nekovalentně vážou na enzym při nízké teplotě a inhibují jeho aktivitu. Po inkubaci trvající 1-5 minut při 95 °C se inhibitor uvolní a reakce se spustí
Taq polymeráza citlivá na chlad: je modifikovaná DNA polymeráza s téměř nulovou aktivitou při nízké teplotě
Chemická modifikace: při této metodě se malá molekula kovalentně naváže na postranní řetězec aminokyseliny v aktivním místě DNA polymerázy. Malá molekula se z enzymu uvolní inkubací reakční směsi po dobu 10-15 minut při teplotě 95 °C. Jakmile se malá molekula uvolní, enzym se aktivuje.
Strukturní modifikace primerůEdit
Dalším přístupem, jak zabránit tvorbě PD nebo ji omezit, je modifikace primerů tak, aby jejich žíhání se sebou samými nebo mezi sebou nezpůsobilo prodloužení.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): na 5′ konec primeru se přidá nukleotidový ocásek, komplementární k 3′ konci primeru. Vzhledem k těsné blízkosti 5′ chvostu se annealizuje na 3′ konec primeru. Výsledkem je primer s kmenovou smyčkou, který vylučuje žíhání zahrnující kratší překryvy, ale umožňuje žíhání primeru na jeho plně komplementární sekvenci v cíli.
Chimerické primery: některé báze DNA v primeru jsou nahrazeny bázemi RNA, čímž vzniká chimerická sekvence. Teplota tání chimerické sekvence s jinou chimerickou sekvencí je nižší než teplota tání chimerické sekvence s DNA. Tento rozdíl umožňuje nastavit teplotu žíhání tak, aby se primer žíhal se svou cílovou sekvencí, ale ne s jinými chimérickými primery.
Primery s blokovanou skupinou: metoda známá jako RNáza H-dependentní PCR (rhPCR) využívá termostabilní RNázu HII k odstranění blokující skupiny z primerů PCR při vysoké teplotě. Tento enzym RNáza HII nevykazuje při nízké teplotě téměř žádnou aktivitu, takže k odstranění bloku dochází pouze při vysoké teplotě. Enzym má také vrozenou diskriminaci neshod mezi primery a templátem, což vede k další selekci proti dimerům primerů.
Zabránění získávání signálu z dimerů primerůUpravit
Zatímco výše uvedené metody jsou určeny ke snížení tvorby PD, jiný přístup je zaměřen na minimalizaci signálu generovaného z PD v kvantitativní PCR. Tento přístup je užitečný, pokud se tvoří málo PD a jejich inhibiční účinek na akumulaci produktu je malý.
Čtyřstupňová PCR: používá se při práci s nespecifickými barvivy, jako je SYBR Green I. Je založena na rozdílné délce, a tedy rozdílné teplotě tání PD a cílové sekvence. Při této metodě je signál získán pod teplotou tání cílové sekvence, ale nad teplotou tání PDs.
Sondy specifické pro sekvence: TaqMan a molekulární majákové sondy generují signál pouze v přítomnosti své cílové (komplementární) sekvence a tato zvýšená specifičnost vylučuje získání signálu (ale ne možné inhibiční účinky na akumulaci produktu) z PD.
.