In vitro antimikrobiální citlivost Aerococcus urinae na 14 antibiotik, a time-kill křivky pro penicilin, gentamicin a vankomycin

Abstrakt

Aerococcus urinae je v klinické a mikrobiologické praxi nováčkem, který způsobuje infekce močových cest, bakteriemii/septikemii a/nebo endokarditidu. Tato studie poprvé představuje hodnocení aktivity reprezentativního panelu antibiotik proti velkému počtu izolátů A. urinae. Citlivost in vitro (MIC) 56 izolátů A. urinae ke 14 antibiotikům byla stanovena ředěním na agaru. Obecně vykazovaly izoláty A. urinae malou variabilitu mezi jednotlivými izoláty a měly nízké MIC vůči penicilinu, amoxicilinu, piperacilinu, cefepimu, vankomycinu a rifampicinu. U žádného z izolátů nebyla zjištěna vysoká rezistence k aminoglykosidům. Střední až dobrá aktivita byla pozorována u chinolonů, erytromycinu a tetracyklinu. U izolátů od dvou pacientů s endokarditidou byly studovány časové křivky pro penicilin, gentamicin a vankomycin. Samotný penicilin a vankomycin vykazovaly proti těmto dvěma kmenům pomalou nebo žádnou baktericidní aktivitu. Při kombinaci penicilinu nebo vankomycinu s gentamicinem bylo dosaženo rychlé baktericidní aktivity pro oba kmeny u obou kombinací. Zdá se, že možnosti léčby A. urinae zahrnují peniciliny pro méně závažné případy. V závažných případech, tj. při endokarditidě, naznačují časově omezená vyšetření příznivý účinek kombinace s gentamicinem. U pacienta alergického na penicilin představuje vankomycin v kombinaci s gentamicinem nejzřejmější alternativu.

Úvod

V průběhu posledního desetiletí byla klinickému významu různých grampozitivních koků s katalázou negativní věnována velká pozornost.1 Mezi nimi je Aerococcus urinae nováčkem v klinické a mikrobiologické praxi, který byl poprvé popsán v roce 19892 a označen v roce 19923. urinae izoláty byly původně rozpoznány podle morfologie buněk (stafylokokům podobné v Gramově barvení) a růstových charakteristik (připomínající α-hemolytické streptokoky na krevním agaru), negativní katalázové reakce a velmi stálého antibiogramu prokazujícího citlivost k penicilinu a rezistenci k sulfonamidům a aminoglykosidům.2-4 Ve dvou zprávách byly kmeny A. urinae izolovány z 0,4-0,8 % vyšetřených vzorků moči.2,5 Většina pacientů, od kterých byl A. urinae izolován, byli starší lidé s predispozičními stavy a příznaky infekce močových cest.2,4,5 Kmeny způsobující infekce močových cest byly rozpoznány v Dánsku, Švédsku, Nizozemsku, Francii, USA, Kanadě a jihoamerických zemích.6A. urinae byl také izolován z krve pacientů trpících urogenní bakteriémií/septikémií s endokarditidou nebo bez ní.7-11 Celostátní průzkum v Dánsku v letech 1987 až 1995 identifikoval 26 pacientů s A. urinae izolovanou z krve,6 což odpovídá 0,5 pacienta/rok/1 milion obyvatel a 0,8 % epizod infekční endokarditidy.8 Bakteriémie/septikemie dobře reagovaly na léčbu samotnými β-laktamy nebo v kombinaci s aminoglykoidem, pokud bakteriémie nebyla komplikována endokarditidou, v těchto případech pět ze šesti pacientů zemřelo. U jednoho pacienta se při pitvě podařilo z chlopní vypěstovat A. urinae, a to i přes zjevně odpovídající antibiotickou léčbu. Proto je třeba stanovit optimální léčbu endokarditidy vyvolané A. urinae.

Testování izolátů A. urinae pomocí tabletových/diskových difuzních metod odhalilo citlivost k široké škále antimikrobiálních látek včetně β-laktamových i neβ-laktamových antibiotik.5,6,12 Vzhledem k tomu, že izoláty A. urinae byly primárně spojovány s infekcemi močových cest, je pozoruhodné, že u těchto kmenů byla zjištěna rezistence k sulfonamidům a dalším antimikrobiálním látkám používaným k léčbě infekcí močových cest, včetně ko-trimoxazolu, trimetoprimu, kyseliny nalidixové a polymyxinů.2,5,6,12 Nedávno byla zkoumána citlivost dvou izolátů A. urinae od pacientů s endokarditidou pomocí MIC sedmi antibiotik a byly provedeny time-kill křivky pro penicilin v kombinaci s gentamicinem nebo netilmicinem.11 Tato studie dále charakterizuje vzorec citlivosti 56 izolátů A. urinae různého geografického původu. Byly stanoveny MIC 14 antibiotik a u dvou izolátů byly provedeny experimenty s časovými křivkami zabití s penicilinem, gentamicinem a vankomycinem, samostatně nebo v kombinaci, s cílem získat více informací o optimálních léčebných režimech závažných infekcí způsobených A. urinae.

Materiál a metody

Kmeny

Padesát šest epidemiologicky nepříbuzných klinických izolátů A. urinae. urinae bylo studováno 42 dánských izolátů (17 krevních a 25 močových) a 14 nedánských močových izolátů: jeden z Nizozemska (laskavě poskytl P. J. G. M. Rietra), čtyři ze Švédska (laskavě poskytl E. Falsen, Culture Collection, University of Göteborg) a sedm severoamerických izolátů (laskavě poskytl R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Byly použity následující referenční kmeny: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 a Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Antimikrobiální látky

Byly použity následující antimikrobiální látky: benzylpenicilin (Leo, Ballerup, Dánsko); cefepim (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, USA); amoxicilin, ceftriaxon, erytromycin, amikacin, gentamicin, netilmicin, rifampicin, vankomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA); oxytetracyklin (Rosco, Taastrup, Dánsko), piperacilin (Lederle, Pearl River, NY, USA), ciprofloxacin (Bayer, Leverkusen, Německo); a sparfloxacin (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Francie).

Stanovení MIC

Vzhledem k rychlému růstu A. urinae musely být podmínky testu upraveny oproti standardním doporučením, aby bylo možné provést stanovení MIC (tj. 5% přídavek krve do agaru a inkubace v 5% atmosféře CO2 po dobu 48 h).13-15 MIC byly stanoveny agarovou ředicí metodou. Dvojnásobná sériová ředění antimikrobiálních látek byla připravena v Mueller-Hintonově agaru (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Německo) doplněném 5 % lyzované koňské krve. Antibiotika byla testována od 0,008 do 512 mg/l, s výjimkou amoxicilinu (0,032-256 mg/l), rifampicinu (0,008-32 mg/l) a oxytetracyklinu (0,008-2 mg/l). Inokuly o koncentraci 107 KTJ/ml (104 KTJ/bod) byly připraveny z jednodenních agarových kultur a suspendovány v 0,9% NaCl a byly aplikovány pomocí 21bodového vícenásobného inokulátoru (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK). Výsledky byly odečteny po dvoudenní inkubaci při 37 °C a 5 % CO2. MIC byla odečtena jako nejnižší koncentrace vykazující růst maximálně tří kolonií.

Vyšetření křivky časového zabíjení

Dva z testovaných krevních izolátů (B1 a B8), oba od pacientů s endokarditidou, byly vyšetřeny. Kmeny byly testovány proti penicilinu (MIC 0,125 a 0,6 mg/l), gentamicinu (MIC 256 a 64 mg/l) a vankomycinu (MIC 0.5 a 1 mg/l) v následujících klinicky dosažitelných koncentracích: penicilin 2× a 10× MIC (P2 a P10); vankomycin 4× a 10× MIC (V4 a V10); gentamicin 10 mg/l (G10); a kombinace penicilin + gentamicin a vankomycin + gentamicin v následujících koncentracích: P2G10, P10G10, V4G10 a V10G10. V t = -1 h byly čerstvé, přes noc vypěstované kolonie suspendovány na cca 105 KTJ/ml ve zkumavkách s předehřátým Todd-Hewittovým bujónem. Zkumavky byly umístěny do vodní lázně při 37 °C. V t = 0 h byla do zkumavek ve dvou opakováních přidána antibiotika připravená bezprostředně před testem. Tři zkumavky bez antibiotik byly použity jako kontrola růstu. Z každé zkumavky byly odebrány vzorky ve dvou opakováních po 0, 3, 6 a 24 hodinách. Vzorky byly sériově naředěny a naočkovány. Počty přežívajících kolonií byly spočítány po celonoční inkubaci při 37 °C na okolním vzduchu v plastových sáčcích spolu s vlhkým hedvábným papírem. Při použití 20 μl vzorků byl minimální spočitatelný počet bakterií 50 KTJ/ml. U pokusů s penicilinem a gentamicinem byl efekt přenosu eliminován přidáním 100 μl 100 000 U/ml penicilinázy na každou destičku. U pokusů s vankomycinem agentamicinem byl carry-over efekt eliminován ředěním. Pilotní šetření prokázalo přenosový efekt u vzorku 100, ale ne u vzorku 10-1, proto byly KTJ počítány s použitím 200 μl vzorků 10-1, což stále dává detekční limit 50 KTJ/ml. Všechny pokusy byly provedeny nejméně dvakrát v různých dnech. Baktericidní aktivita byla definována jako snížení inokula nejméně o 99,9 % během 24 h. Synergie (S), aditivní účinek (A) a antagonismus byly definovány jako: >2 log více usmrcení (S), >1 a <2 log více usmrcení (A) a >2 log snížení usmrcení pro kombinaci ve srovnání s nejlepším z jednotlivých antibiotik.

Výsledky

Stanovení MIC

MIK získané pro 56 izolátů jsou uvedeny v tabulce. Při použití breakpointů pro streptokoky doporučených NCCLS14,15 nebo Švédskou referenční skupinou pro antibiotika (SRGA),16,17 byly izoláty citlivé na peniciliny, zatímco u testovaných cefalosporinů byla zjištěna snížená citlivost. MIC pro aminoglykosidy ukázaly sníženou citlivost téměř u všech izolátů. U žádného z izolátů však nebyla zjištěna vysoká rezistence k aminoglykosidům (tj. gentamicin > 1000 mg/l). Všechny izoláty byly citlivé na vankomycin. Rifampicin byl nejúčinnějším testovaným léčivem s MIC50 0,031 mg/l (rozmezí <0,004-0,064 mg/l), s výjimkou jednoho izolátu s MIC > 32 mg/l (opakované testování). Aktivita chinolonů ciprofloxacinu a sparfloxacinu byla shledána stejně dobrou.

Vyšetření křivky usmrcení

Průměrné časové křivky usmrcení pro každý experiment jsou uvedeny na obrázku. Samotný vankomycin (4× i 10× MIC) vykazoval baktericidní aktivitu proti kmeni B1. U penicilinu byla baktericidní aktivita zjištěna pouze pro 10× MIC proti kmeni B8. U obou antibiotik byl baktericidní účinek pomalý, tj. poprvé se objevil po 24 h. Gentamicin nebyl baktericidní – ve většině pokusů byl pozorován růst. Penicilin v kombinaci s gentamicinem působil synergicky a byl rychle baktericidní pro kmen B8 v P2G10 i P10G10. U kmene B1 však byl zjištěn pouze aditivní a pomalý baktericidní účinek. Při kombinaci vankomycinu s gentamicinem byl zjištěn rychlý baktericidní účinek pro oba kmeny. Synergický účinek byl zjistitelný po 3 h a 6 h u kmene B8. Po 24 h však byla usmrcující aktivita vankomycinu tak výrazná, že synergický účinek nebylo možné zjistit. U kmene B1 byl zjištěn pouze aditivní účinek. V žádném z experimentů nebyl zaznamenán antagonistický účinek.

Diskuse

Tato studie poprvé představuje hodnocení MIC reprezentativního panelu antibiotik proti velkému počtu izolátů A. urinae získaných od pacientů s infekcí močových cest, bakteriémií/septikémií a/nebo endokarditidou. Za účelem vyhodnocení použití antibiogramů pro taxonomické účely byly již dříve zkoumány MIC 15 antibiotik pro 10 kmenů A. urinae,12 ale podrobné údaje nebyly prezentovány.

A. urinae jsou rychlokvašné organismy vyžadující doplnění krve do média a někdy inkubaci v atmosféře obohacené CO2 a/nebo prodlouženou inkubační dobu, aby se dosáhlo dostatečného růstu pro testování citlivosti na antibiotika. Proto nemohly být kmeny testovány za standardních podmínek, jak je popisuje BSAC nebo NCCLS.13-15 Nutnost úpravy kultivačních podmínek je však u rychlých grampozitivních bakterií běžným problémem.18,19 Izoláty A. urinae vykazovaly podobný vzorec antimikrobiální citlivosti jako α-haemo-lytické streptokoky s pouze malými rozdíly v citlivosti mezi jednotlivými izoláty. MIC β-laktamů u izolátů byly typicky v rámci čtyř dvojnásobných stupňů ředění, s výjimkou cefalosporinů ceftriaxonu a cefepimu, které vykazovaly větší rozdíly v MIC (tabulka). Vzhledem k možnému vlivu inkubace v CO2 (snížení pH) je třeba dbát opatrnosti při posuzování citlivosti k tetracyklinu (nadhodnocená citlivost) a erytromycinu (podhodnocená citlivost). Mezi zkoumanými izoláty A. urinae nebyla zjištěna žádná vysoká rezistence vůči testovaným aminoglykosidům, což ponechává možnost synergického účinku v kombinaci s β-laktamem nebo vankomycinem (vide infra). Podle MIC existuje několik alternativ léčby závažných infekcí, protože izoláty byly citlivé na penicilin, vankomycin a rifampicin (s výjimkou jednoho izolátu). Vybrané chinolony, ciprofloxacin a sparfloxacin, rovněž vykazovaly dobrou aktivitu. Ačkoli se jedná o rychlý organismus, výsledky získané diskovými difuzními metodami2,5,20 byly v souladu s MIC uvedenými v této studii, což naznačuje, že pomocí těchto rutinních metod citlivosti lze získat spolehlivý výsledek.

Pokyny pro léčbu závažných infekcí, jako je sepse s endokarditidou nebo bez ní, by měly být optimálně založeny na klinických zkušenostech v pečlivě navržených studiích, což je však obtížné, pokud se jedná o vzácné bakterie. Proto mohou studie in vitro zahrnující techniky křivky usmrcení poskytnout v těchto případech klinikům důležité informace.

Pro experimenty byly zvoleny koncentrace antibiotik dosažitelné in vivo. Pro gentamicin byla zvolena dávka 10 mg/l, což odpovídá koncentraci dosažené při dávkování 240 mg jednou denně (odpovídá 3-4 mg/kg).21 Kromě toho, ačkoli některé práce doporučují u endokarditidy dávkování dvakrát denně, v Dánsku se běžně používá gentamicin jednou denně, a to z důvodu snížení nefrotoxicity a skutečnosti, že synergický účinek s β-laktamovými antibiotiky se zvyšuje se zvyšující se koncentrací aminoglykosidu.22 Údaje získané v naší in vitro studii usmrcujících křivek pro penicilin a vankomycin ukázaly, že ani penicilin, ani vankomycin nebyly baktericidní vůči žádnému ze dvou testovaných izolátů od pacientů s infekční endokarditidou. V kombinaci s gentamicinem bylo dosaženo baktericidního účinku proti oběma izolátům jak pro penicilin, tak pro vankomycin. Tyto režimy jsou naštěstí celosvětově doporučovány pro léčbu infekční endokarditidy neznámé etiologie.23 Míra usmrcení obou kmenů se lišila, což naznačuje, že mohou existovat mezikmenové rozdíly. Navzdory citlivosti in vitro na podávaná antibiotika jsme zjistili, že prognóza starších pacientů trpících infekční endokarditidou způsobenou A. urinae je špatná.8 Současné výsledky pro penicilin, gentamicin a netilmicin (MIC) jsou v souladu s výsledky uvedenými v nedávné švýcarské zprávě Zbindena a kol.11 pro dva izoláty A. urinae od pacientů s endokarditidou.

Mezi možnosti léčby A. urinae zřejmě patří penicilin pro méně závažné případy. V těžkých případech, tj. u endokarditidy, naznačují časová šetření přínos kombinace penicilinu nebo vankomycinu s gentamicinem. U pacienta alergického na penicilin představuje vankomycin nejzřejmější alternativu.

Tabulka.

MIC 14 antimikrobiálních látekr A. urinae (n = 56)

Horní hranice citlivosti pro streptokoky podle NCCLS15 nebo podle SRGA16,17 vyznačená šedým stínováním.

aPočet kmenů.

bMIC *< 0,032 mg/l.

cMIC > 32 mg/l.

dMIC > 2 mg/L

Tabulka.

MIC 14 antimikrobiálních látekr A. urinae (n = 56)

Horní hranice citlivosti pro streptokoky podle NCCLS15 nebo podle SRGA16,17 vyznačená šedým šrafováním.

aPočet kmenů.

bMIC *< 0,032 mg/l.

cMIC > 32 mg/l.

dMIC > 2 mg/L

.