Subjekty
Této studie se zúčastnilo 88 pacientů s LC bez vzdálených metastáz. U všech pacientů byl na základě patologického vyšetření vzorků diagnostikován dlaždicobuněčný karcinom hrtanu a byli léčeni na Klinice otorinolaryngologie, chirurgie hlavy a krku, University of the Ryukyus, v období od ledna 2008 do prosince 2017. Konečná prognóza pacientů byla posouzena v červenci 2018. Klasifikace stadia nádoru, uzlin a metastáz (TNM) byla provedena podle příručky AJCC Staging Manual (7. vydání). Za účelem stanovení klinického stadia a odhalení souběžných vícečetných primárních nádorů podstoupili pacienti fyzikální a endoskopické vyšetření horní části gastrointestinálního traktu, ultrazvukovou kontrolu krku, počítačovou tomografii (CT) a CT zobrazení s 18F-fluorodeoxyglukózou a pozitronovou emisní tomografií.
Tato studie byla schválena Institutional Review Board of the University of the Ryukyus a byla provedena v souladu s Helsinskou deklarací z roku 1975 ve znění z roku 2008. Před zařazením do studie byl od všech pacientů s LC získán informovaný souhlas.
Léčba
Hlavní léčbou primární léze s kurativním záměrem byla samotná konvenční radioterapie (RT) nebo laserová resekce v případě T1, současná chemoradioterapie (CCRT) v případě T2, CCRT nebo operace v případě T3 a operace v případě T4 bez ohledu na přítomnost HPV. Nodální léze byly řešeny pomocí CCRT nebo disekce krku v kombinaci s resekcí primární léze. Všichni pacienti, kteří podstoupili RT (celková dávka 70 Gy), měli CT asistované trojrozměrné plánování léčby zářením v léčebné poloze s imobilizací maskou. Protokol pro CCRT byl stejný, jak bylo uvedeno dříve . Pokud primární nádor v T3 nevykazoval částečnou odpověď bez ohledu na odpověď krčních lymfatických uzlin při ozáření 39,6 Gy, podstoupili pacienti kurativní operaci primární léze kombinovanou s disekcí krku.
Detekce HPV statusu a imunohistochemie p16
Všechny vzorky tkáně z primárních lézí bez ozařování nebo chemoterapie byly analyzovány pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) pro detekci HPV DNA s použitím čerstvě zmrazených vzorků, které byly získány při biopsii nebo chirurgické resekci, a imunohistochemie p16 s použitím vzorků FFPE. Případy s negativním výsledkem detekce HPV při PCR a nadměrnou expresí p16 (≥ 75 % pozitivních buněk a alespoň střední intenzita barvení) byly dále hodnoceny na HPV status pomocí in situ hybridizace (ISH) se sondami HPV DNA (DNA ISH) . Kvantitativní PCR v reálném čase (qPCR) pro stanovení virové nálože a fyzického stavu, jak je popsáno níže, byla provedena v případech, které obsahovaly HPV-16 .
PCR pro detekci HPV DNA
V krátkosti byla DNA izolována ze vzorků nádorů pomocí soupravy Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). Přítomnost a integrita DNA byla u všech vzorků ověřena pomocí PCR amplifikace β-globinového genu s použitím primerů PC04 a GH20 . K analýze přítomnosti HPV DNA pomocí PCR byly použity obecné konsenzuální sady primerů GP5+/GP6+ a MY09/MY11 (tabulka 1), jak bylo popsáno dříve . Kromě toho byly vzorky DNA negativní pro GP5+/GP6+ nebo MY09/MY11 PCR reamplifikovány pomocí metody nested PCR s dvojicí primerů GP5+/GP6+. Produkty PCR očekávané velikosti (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) byly přečištěny a přímo sekvenovány pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekvence byly zarovnány a porovnány pomocí programu BLAST se sekvencemi známých typů HPV v databázi GenBank.
Imunohistochemie p16
Imunohistochemie p16 byla provedena pomocí soupravy CINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Německo) podle protokolu výrobce . Imunoznačení bylo vizualizováno inkubací v 3,3′-diaminobenzidinu a obarvené preparáty byly protibarveny hematoxylinem.
Kritéria hodnocení imunoreaktivity p16 použitá v této studii byla následující: 0, žádné barvení; 1, 1 – < 25 % nádorových buněk pozitivních na p16; 2, 25 – < 50 % pozitivních; 3, 50 – < 75 % pozitivních; 4, ≥75 % pozitivních a slabá intenzita barvení; a 5, ≥75 % pozitivních a alespoň střední intenzita barvení. Termín „nadměrná exprese p16“ (p16-pozitivní) byl v této studii definován jako skóre 5.
ISH se sondami HPV DNA
Biotinyl tyramidová ISH byla provedena pomocí GenPoint™ HPV biotinylované DNA sondy a GenPoint tyramidového systému zesílení signálu pro biotinylované sondy podle protokolu výrobce (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). GenPoint HPV biotinylovaná DNA sonda reaguje s HPV typy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 a 68 ve 4 μm silných řezech vzorků FFPE. Detekce hybridizované sondy byla provedena pomocí detekčního systému GenPoint podle protokolu výrobce se zahrnutou primární streptavidin-křenovou peroxidázou (HRP), biotinyl tyramidem, sekundárním streptavidinem-HRP a 3,3′-diaminobenzidinem l (Dako; Agilent Technologies). Sklíčka byla protibarvena hematoxylinem.
Ocenění virové nálože a fyzikálního stavu HPV-16 pomocí qPCR
K vyhodnocení virové nálože a fyzikálního stavu HPV-16 byla provedena qPCR, jak bylo popsáno dříve . Stručně řečeno, byly použity primery a sondy TaqMan zaměřené na otevřené čtecí rámce HPV-16 E2 a E6 (tabulka 1). Primery a sondy rozpoznávají oblast závěsu E2, která je při integraci HPV-16 odstraněna. Dvě standardní křivky pro geny E2 a E6 byly vytvořeny amplifikací desetinásobných sériových ředění (101, 102, 103, 104, 105 a 106 virových kopií) plazmidu pB-actin early, který byl darem od Karla Mungera a nese kompletní oblast genu HPV-16 early (plazmid Addgene č. 13711; Addgene, Cambridge, MA). Virová nálož DNA byla hodnocena výpočtem počtu kopií E6. Pro kvantifikaci buněčné DNA byla vytvořena externí standardní křivka s použitím známých sériových ředění (0,3, 3, 30 a 300 ng) lidské genomové placentární DNA (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Německo) a β-globin byl amplifikován, jak bylo popsáno dříve. Množství DNA bylo vypočteno vynesením hodnot Cq proti logaritmu standardní křivky. Fyzikální stav HPV-16 byl hodnocen na základě dříve publikované metody . Poměr E2/E6 ≥ 1 znamená převahu epizomální formy, zatímco poměr počtu kopií E2/celkový počet E6 < 1 znamená přítomnost integrované i epizomální formy (smíšená forma).
Detekce exprese mRNA E6 pomocí qPCR a ISH RNA u HPV-16 pozitivních pacientů s nadměrnou expresí p16
Exprese mRNA E6 byla detekována ve vzorcích od pacientů identifikovaných jako HPV-16 pozitivní s nadměrnou expresí p16. Celková RNA byla extrahována ze zmrazených tkání pomocí RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japonsko) podle pokynů výrobce. Celková RNA (500 ng) byla použita k syntéze prvního vlákna cDNA pomocí sady PrimeScript™ RT Reagent Kit s gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) podle pokynů výrobce. Pro měření exprese HPV-16 E6 mRNA byla provedena qPCR pomocí detekčního systému CFX96 Touch™ Real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules, CA) a TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Byly použity primery a sondy TaqMan (tabulka 1), které cílí na gen HPV-16 E6 a gen β-aktin . Sonda β-aktinu byla značena FAM na 5′ konci a TAMRA na 3′ konci (Applied Biosystems Japan, Tokio, Japonsko). Podmínky amplifikace byly následující: 2 minuty při 50 °C, 10 minut při 95 °C a dvoufázový cyklus 95 °C po dobu 15 s a 60 °C po dobu 60 s, celkem 40 cyklů. Dvě standardní křivky byly vytvořeny pro geny E6 a β-aktin amplifikací sériových desetinásobných ředění (101, 102, 103, 104, 105 a 106 kopií) plazmidu pB-actin early a plazmidu pCAG-mGFP-actin, který byl darem od Ryoheie Yasudy a nese kompletní kódující oblast β-aktinu (Addgene plasmid # 21948; Addgene). Exprese genu E6 v každém vzorku byla normalizována množstvím vnitřní kontroly β-aktinu.
RNA ISH pro HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA byla provedena pomocí sady RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) podle pokynů výrobce. Stručně řečeno, sériové řezy vzorků FFPE o tloušťce 4 μm byly deparafinovány v xylenu a rehydratovány pomocí odstupňované série alkoholu. Endogenní peroxidáza byla blokována pomocí RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagent při pokojové teplotě po dobu 10 minut. Retrieval cílové HPV RNA byl proveden v RNAscope® Target Retrieval Reagent při 100 °C po dobu 15 min. Sklíčka byla štěpena pomocí RNAscope® Protease Plus při 40 °C po dobu 30 min. K řezům byla přidána RNA sonda HPV-16/- 18 E6/E7 (RNAscope® Probe-HPV16/18) a bylo přiloženo krycí sklíčko. Preparáty byly přeneseny do zvlhčené komory pro hybridizaci při 40 °C po dobu 2 h. Poté byly krycí sklíčka odstraněna a preparáty byly promyty RNAscope® Wash Buffer Reagent při 40 °C. Amplifikace signálu byla provedena podle pokynů výrobce. Detekce hybridizované sondy byla provedena pomocí 3,3′-diaminobenzidinu (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). Sklíčka byla protibarvena hematoxylinem. Pozitivní kontrolní sklíčka (HeLa buňky exprimující HPV-18 E6/E7 mRNA) byla zahrnuta do RNA ISH. Pozitivní barvení bylo identifikováno jako hnědé bodové tečky viditelné v jádře a/nebo cytoplazmě.
Statistická analýza
Pearsonův chí-kvadrát test byl použit k porovnání charakteristik pacientů s LC podle stavu HPV DNA a nadměrné exprese p16. Kumulativní přežití (CS) bylo vypočteno pomocí Kaplanovy-Meierovy metody a bylo porovnáno mezi dvěma skupinami pomocí log-rank testu. Všechny analýzy byly provedeny pomocí statistického balíku SPSS (SPSS, verze 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 bylo považováno za významné.