Exprese a purifikace GyrB a GyrA
Sekvence kódující plnou délku E. coli GyrA (2-875) byla vložena do modifikovaného pET28b obsahujícího N-terminální značku 10-His a C-terminální značku Twin-strep. Nadměrná exprese byla provedena v E. coli BL21 (DE3) pRARE2 v LB médiu obsahujícím 50 µg/ml kanamycinu a 35 µg/ml chloramfenikolu. Buňky byly indukovány 0,35 mM IPTG po dosažení OD600 0,85 a protein byl exprimován při 37 °C po dobu 4 h. Buňky byly sklizeny a resuspendovány v lyzačním pufru (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10 % v/v glycerol, pH 8,0) a lyzovány třemi cykly vysokotlaké disrupce pomocí EmulsiFlex-C3 při tlaku 1500 barů. Protein GyrA byl purifikován pomocí niklové afinitní chromatografie na ručně balené koloně XK 26/20 (Pharmacia) s chelatační pryskyřicí Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) s navázanými ionty Ni2+ . Eluce byla provedena lyzačním pufrem obsahujícím 250 mM imidazol o pH 8,0 a eluované proteiny byly přímo navázány na 10 ml streptavidinové sepharosy (GE Healthcare). Proteiny byly intenzivně promyty Strep pufrem (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glycerol, pH 8,0) a eluovány Strep pufrem obsahujícím 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich). Značka 10-His i značka Twin-strep byly následně štěpeny proteázou PreScission (P3C) a štěpením tabákovým etherem (TEV) (hmotnostní poměr 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) přes noc při 4 °C. GyrA byl poté dále přečištěn pomocí aniontové výměnné chromatografie na koloně HiTrap Q HP (GE Healthcare). Protein byl eluován lineárním gradientem 20 objemů kolony s pufrem B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v glycerol, pH 8,0). Frakce obsahující GyrA byly sloučeny a vloženy na velikostně vylučovací chromatografickou kolonu Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) s použitím 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10 % v/v glycerolu, pH 8,0. Ze 3 l kultur bylo získáno 37 mg GyrA. Do stejně upraveného pET28b byla vložena kódující sekvence GyrB (2-804). Nadměrná exprese byla provedena v E. coli BL21 (DE3) pRARE2 v LB médiu obsahujícím 50 µg/ml kanamycinu a 35 µg/ml chloramfenikolu. Buňky byly indukovány 0,35 mM IPTG po dosažení OD600 0,85 a protein byl exprimován při 18 °C po dobu 18 h. Postup purifikace GyrB je stejný, jako je popsán výše pro GyrA. Ze 3 l kultur bylo získáno 10 mg GyrB.
Plná rekonstituce DNA gyrázy
E. coli GyrA a GyrB byly smíchány v ekvimolárním poměru, aby byla umožněna plná rekonstituce DNA gyrázy. Komplex byl dále přečištěn na velikostně vylučovací chromatografické koloně Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) za použití kryo-EM pufru (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (obr. 1 a doplňkový obr. 2). 1).
Příprava nukleové kyseliny
Duplex DNA o délce 180 bp byl rekonstituován pomocí 2 fosforylovaných asymetrických syntetických oligonukleotidů12 získaných od firmy Sigma-Aldrich (doplňková tabulka 1). Nukleové kyseliny byly stručně řečeno rozpuštěny ve vodě bez DNAse v koncentraci 1 mM. Pro sestavení dvouvláknové DNA se každé oligo smíchalo v molárním poměru 1:1, žíhalo se inkubací při 95 °C po dobu 2 min a poté se teplota snižovala o 1 °C každou 1 min až do dosažení 20 °C. Žíhaný dvojnásobně zaříznutý duplex DNA byl poté vyměněn v pufru Hepes 20 mM pH 8,0 pomocí kolony BioSpin 6 (BioRad).
Tvorba komplexu pro kryoEM
Purifikovaná DNA gyráza byla smíchána se 180 bp dsDNA v molárním poměru 1:1 s konečnou koncentrací proteinu a DNA 32 µM. Směs byla inkubována 10 min při 37 °C. Gepotidacin (GSK2140944, zakoupen v MedChemExpress) resuspendovaný v koncentraci 10 mM ve 100% DMSO byl přidán k dosažení konečné koncentrace 170 µM (1,7% DMSO). Směs byla inkubována 10 minut při 37 °C. Ke komplexu byl přidán AMP-PNP (Sigma) v konečné koncentraci 340 µM. Plně rekonstituovaný komplex byl dále inkubován 30 min při 30 °C. Nakonec bylo ke komplexu přidáno 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich). Vzorek byl odstředěn 2 h při 16 000 × g, aby se odstranily případné agregáty.
Příprava kryoEM mřížky
Měděné mřížky Quantyfoil R-1,2/1,3 s 300 oky byly před aplikací 4 µl komplexu 20 s žhaveny. Po 30 s inkubace byly mřížky ponořeny do kapalného etanu pomocí přístroje Vitrobot mark IV (FEI) s 95% vlhkostí v komoře při 10 °C.
Elektronová mikroskopie
KryoEM zobrazování bylo provedeno na mikroskopu Titan Krios pracujícím při 300 kV (FEI) vybaveném přímou elektronovou kamerou K2 Summit (Gatan), energetickým filtrem GIF Quantum (Gatan) pracujícím v režimu nulových energetických ztrát s šířkou štěrbiny 20 e-V, fázovou deskou Volta (FEI) a CS korektorem (FEI). Snímky byly zaznamenány v režimu nanosondy EFTEM se sériovým EM53 v režimu superrozlišovacího počítání při jmenovitém zvětšení 130 000x s velikostí superrozlišovacího pixelu 0,44 Å a konstantním rozostřením terče -500 nm (doplňkový obr. 2c). VPP byl každých 100 min posunut do nové polohy (doplňkový obr. 2b). Na detektoru byly shromážděny čtyři sady dat s dávkovým příkonem 6 až 8 e-/pixel/s (velikost pixelu u vzorku 0,88 Å). Snímky byly zaznamenány s celkovou dávkou 50 e-/Å2, dobou expozice 7 až 10 s a dílčími snímky 0,2 až 0,25 s (celkem 35 až 50 snímků). Po shromáždění dat ze 4 sad dat bylo zaznamenáno celkem 11 833 filmů.
Zpracování dat
Zpracování dat z každé sady dat bylo provedeno samostatně podle stejného postupu až do 3D zpřesnění, kdy byly částice sloučeny. Dílčí snímky superrozlišení s dávkovou frakcí byly korigovány na zisk pomocí IMOD54 a dvakrát binovány pomocí Fourierova ořezu, korigovány na drift a váženy na dávku pomocí MotionCor255 , čímž vznikly součtové snímky s velikostí pixelu 0,88 Å. Funkce přenosu kontrastu korigovaných mikrofotografií byla odhadnuta pomocí GCTF v1.0656. Kroužky Thon byly ručně zkontrolovány na astigmatismus a mikrofotografie s naměřeným rozlišením horším než 4 Å byly vyřazeny, čímž bylo získáno 8 701 zbývajících mikrofotografií. Částice byly automaticky vybrány pomocí bezreferenčního protokolu Gaussian blob picking v programu RELION229,30. Při součtu všech 4 souborů dat bylo vybráno celkem 1 572 962 částic. Čtyřikrát binované částice z každého souboru dat byly samostatně podrobeny dvěma kolům 2D klasifikace v programu RELION2, aby se odstranily nevyžádané částice a kontaminace, což vedlo k získání celkem 479 667 částic pro další zpracování. Částice ze čtyř datových sad byly sloučeny do jedné jedinečné datové sady, po níž následovala opětovná extrakce s centrováním ve formátu 3 × 3 binovaných částic. Poté bylo provedeno poslední kolo 2D klasifikace, jehož výsledkem byl konečný zásobník částic o 338 616 částicích. Následný zásobník částic byl podroben jednomu kolu 3D ab-initio klasifikace v programu cryoSPARC31. Po vyřazení nekvalitních modelů byl výsledkem zbývajícího modelu ab-initio konečný soubor dat 191 456 částic s prahovou hodnotou pravděpodobnosti třídy 0,9 (doplňkový obr. 2a). Model ab-initio byl filtrován dolní propustí na 30 Å a byl použit jako reference pro homogenní zjemnění v programu cryoSPARC, jehož výsledkem byla mapa 5,4 Å. Rafinované souřadnice částic byly poté použity pro lokální odhad CTF pomocí GCTF v1.06, po kterém následovala reextrakce 2 × 2 binovaných částic s centrováním. Tento nový stack částic byl podroben 3D automatickému upřesnění v programu RELION2 pomocí modelu ab-initio filtrovaného dolní propustí na 30 Å, čímž vznikla mapa s globálním rozlišením 5,0 Å (doplňkový obr. 3). Lokální rozlišení vykazovalo rozsah rozlišení od 4,0 Å v jádru vázajícím/odstraňujícím DNA po 9,0 Å v ATPázové doméně a β-kolíčku GyrA obepínajícím DNA, což svědčí o vysoké flexibilitě těchto dvou modulů. Abychom získali konečnou rekonstrukci celého komplexu s dobře definovanými hustotami pro každou doménu, provedli jsme 3D klasifikaci bez zarovnání, čímž jsme získali několik různých tříd. Částice ze tří tříd byly sloučeny (94 633 částic). Následný zásobník částic s rozměry 1 × 1 byl vylepšen v programu RELION2 bez masky až do pozdních iterací vylepšování, kdy byla použita měkká maska pro zlepšení rozlišení. Následným zpracováním mapy byla získána rekonstrukce celého komplexu s rozlišením 6,6 Å (doplňkový obr. 3).
K identifikaci různých konformací a zlepšení lokálního rozlišení jednotlivých domén byla použita kombinace různých lokálních přístupů. Protože doména ATPázy byla příliš malá pro 3D zaměřené zpřesnění, provedli jsme nejprve zaměřenou 3D klasifikaci domény ATPázy s měkkou maskou a bez zarovnání v programu RELION2. Byla vybrána jedna třída 58 329 částic s dobře definovanou hustotou domény ATPázy, po níž následovala reextrakce částic s velikostí 1 × 1, čímž byly získány částice s velikostí pixelu 0,88 Å/pixel. Pro usnadnění přesného zarovnání částic byla tato třída dále upřesněna v programu RELION2 pomocí měkké masky kolem ATPázové domény a domény vážící/odstraňující DNA, čímž byla získána mapa s globálním rozlišením 5,9 Å (ATPase-Core) (Doplňkový obr. 3).
Druhé jsme provedli cílenou 3D klasifikaci β-kolíčku GyrA s měkkou maskou a bez zarovnání v programu RELION2. Byla vybrána jedna třída 45 040 částic s dobře definovanou hustotou β-pinwheel GyrA, po níž následovala opětovná extrakce částic s velikostí 1 × 1, čímž jsme získali částice s velikostí pixelu 0,88 Å/pixel. Tato třída byla dále zpřesněna v programu RELION2 pomocí měkké masky kolem β-kolíčku a DNA-vazebně-odštěpné domény, čímž byla získána mapa s rozlišením 6,3 Å (CTD-Core) (Doplňkový obr. 3).
Nakonec bylo v programu RELION2 provedeno cílené 3D automatické zpřesnění pomocí měkké masky kolem DNA-vazebně-odštěpné domény. Následným zpracováním mapy byla získána rekonstrukce domény vázající/odstraňující DNA s rozlišením 4,3 Å. Poté byla provedena cílená 3D klasifikace domény vázající DNA/cleavage. Dvě z tříd vykazovaly lepší úhlovou přesnost a odlišné uzavřené (60 548 částic) a předotevřené konformace (53 655 částic) DNA vazebné/odštěpné domény. Tyto dvě třídy byly v programu RELION2 dále zpřesněny cíleným 3D zpřesněním se symetrií C2 pomocí částic s binováním 1 × 1 a po následném zpracování poskytly rekonstrukce s globálním rozlišením 4,0, resp. 4,6 Å (doplňkový obr. 3). Uzavřená doména vázající/odstraňující DNA byla dále zpřesněna cíleným 3D zpřesněním s použitím měkké masky, která vylučuje neuspořádanou vložku TOPRIM a poskytuje mapu vysoké kvality 4,0 Å (Doplňkový obr. 3).
Všechna uváděná rozlišení jsou založena na zlatém standardu kritéria FSC-0,14357 a FSC-křivky byly korigovány o konvoluční efekty měkké masky pomocí substituce šumu58 v RELION2 i v kryoSPARC s vysokým rozlišením (Doplňkový obr. 4a). Všechny rekonstrukce byly zostřeny použitím záporného B-faktoru, který byl odhadnut pomocí automatických postupů59. Lokální rozlišení map bylo vypočteno pomocí programu Blocres60 (doplňkový obr. 4c). KryoEM mapy celého komplexu, jádra ATPasy, jádra CTD a domény vážící/odstraňující DNA v uzavřeném stavu (s vloženým TOPRIM a bez něj) a ve stavu před otevřením byly uloženy v EM Data Bank pod přístupovými čísly EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912, resp.
Tvorba a zpřesnění modelu
Nejkvalitnější byla EM rekonstrukce domény vázající/odstraňující DNA, v níž chybí vložka TOPRIM, vyřešená při 4,0 Å. Byly vidět téměř všechny postranní řetězce a hustota gepotidacinu byla jasně viditelná. Tato mapa byla použita ke zpřesnění krystalové struktury DNA-vázající/cleavage domény DNA gyrasy E. coli17. Dimerický atomární model DNA-vazebné/cleavage domény byl vytvořen pomocí PDB 3NUH v programu PyMol (Schrodinger L.L.C.). Následný atomární model byl zbaven aminokyselin patřících do vložky TOPRIM, všech iontů a molekul vody, přičemž všechny obsazenosti byly nastaveny na 1 a B-faktor byl nastaven na 50. Nejprve byl atomární model vybaven rigidním tělesem ve filtrované a zostřené mapě pomocí programu Chimera61. Bylo provedeno první kolo zjemnění v reálném prostoru v programu PHENIX62 s použitím lokálního přizpůsobení v reálném prostoru a globálního zjemnění s minimalizací řízenou gradientem. Poté bylo zkopírováno 20 nukleových kyselin ze struktury DNA gyrázy S. aureus41 (PDB 5IWM) a přizpůsobeno našemu atomárnímu modelu. Sekvence DNA byla upravena podle DNA použité v naší struktuře. Chybějící proteinové zbytky a nukleové kyseliny byly ručně sestaveny v programu COOT63. Atomový model a slovník omezení gepotidacinu (GSK-2140944) byly vytvořeny pomocí serveru Grade (http://grade.globalphasing.org). Gepotidacin byl poté ručně dosazen do prázdné elektronové hustoty v COOT a následně duplikován. Obě duplikatury byly nastaveny na 0,5 obsazení. Bylo provedeno několik kol upřesnění v reálném prostoru v programu PHENIX s použitím omezení pro sekundární strukturu, rotamery, Ramachandrana a nekrystalografickou symetrii, po nichž vždy následovala ruční kontrola v COOT, dokud nebyl získán konvergující model. Nakonec byly B-faktory upřesněny posledním kolem upřesnění v reálném prostoru v programu PHENIX za použití stejných nastavení jako předtím. Po konvergenci zpřesnění byly do atomárního modelu přidány atomární souřadnice vložení TOPRIM. Ta byla dále zpřesněna v EM rekonstrukcích obsahujících hustotu vložení v uzavřených a předotevřených stavech stejným postupem. Byla provedena křížová validace poloviční mapy, která určila hodnotu 1,5 jako nejlepší váhu zpřesnění v systému PHENIX umožňující snížení střetu atomů a zabránění přetvoření modelu (doplňkový obr. 4e). Všechny kroky zpřesnění byly provedeny s použitím limitu rozlišení rekonstrukcí podle zlatého standardu kritéria FSC-0.14357. Parametry zpřesnění, statistiky modelu a validační skóre jsou shrnuty v doplňkové tabulce 2. Atomové modely domény vázající/odstraňující DNA E. coli v uzavřené (s vložením a bez vložení) a předotevřené konformaci byly uloženy v Protein Data Bank pod přístupovými čísly 6RKU, 6RKS, resp. 6RKV.
Pro celkový komplex jsme použili kombinaci různých EM rekonstrukcí k sestavení atomového modelu celkového komplexu DNA gyrázy. Struktura ATPase-Core vyřešená na 5,9 Å byla použita k rigid-body fitování v Chiméře krystalové struktury ATPase domény v komplexu s ADPNP32 (PDB 1EI1) a DNA vazebné/odstraňovací domény rafinované v uzavřené konformaci. Kvalita elektronové hustoty umožnila v COOT doplnit chybějící zbytky linkeru mezi ATPázovou doménou a DNA-vázající/odstraňující doménou. Struktura CTD-Core vyřešená na 6,3 Å byla použita k přesnému fitování krystalové struktury β-pinwheel10 v programu Chimera. Chybějících 10 aminokyselin (564-574) následujících za GyrA-boxem bylo doplněno pomocí modelovacího serveru Phyre264. Kvalita elektronické hustoty umožnila vytvořit v COOT chybějící nukleové kyseliny kolem β-kolíčku a také 10 aminokyselin spojujících poslední zbytky GyrA s β-kolíčkem. Na základě předpovědi sekundární struktury byla část linkeru sestavena jako alfa šroubovice (obr. 3). Následný atomární model obsahující ATPázovou doménu, DNA-vazebnou/odstraňovací doménu a jeden β-kolíček byl pomocí programu Chimera rigid-body fitován do celkové struktury komplexu řešené na 6,6 Å. Poté byla kopie prvního β-pinwheel napasována na hustotu druhého β-pinwheel v COOT. Chybějící nukleové kyseliny kolem druhého β-kolíčku a také chybějících 10 zbytků linkeru byly v COOT sestaveny ručně. Výsledný atomový model byl zbaven všech iontů a molekul vody, přičemž všechny obsazenosti byly nastaveny na 1 a B-faktory na 50. Nakonec bylo v programu PHENIX provedeno zpřesnění atomárního modelu v reálném prostoru oproti celkové komplexní struktuře pomocí zpřesnění s využitím tuhého tělesa a globální minimalizace řízené gradientem. Limit rozlišení pro rafinaci byl nastaven podle zlatého standardu kritéria FSC-0.14357. Byly rovněž provedeny křížové validace poloviční mapy (doplňkový obr. 4e). Parametry zpřesnění, statistiky modelu a výsledky validace jsou shrnuty v doplňkové tabulce 2. Atomový model celkové struktury byl uložen v Protein Data Bank pod přístupovými čísly 6RKW. Všechny obrázky byly vytvořeny pomocí programů Chimera61, ChimeraX65 a PyMol (Schrodinger L.L.C.).
Purifikace E. coli GyrB R286K, R286Q a E264A
Modifikovaný pET28b použitý pro purifikaci divokého typu E. coli R286K, R286Q a E264A
. coli GyrB byla mutována pomocí místně řízené mutageneze pomocí soupravy QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent) za účelem vytvoření tří plazmidů nesoucích mutace R286K, R286Q nebo E264A (doplňková tabulka 4). Postupy pro nadměrnou expresi a purifikaci těchto tří mutantů jsou totožné s postupy pro divoký typ GyrB popsanými výše v části Metody.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q purifikace
Modifikovaný pET28b použitý pro divoký typ T. thermophilus GyrB nadměrnou expresi12 , byl mutován pomocí mutageneze řízené na místě pomocí soupravy QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis (Agilent) za účelem vytvoření dvou plazmidů nesoucích mutace K284R nebo K284Q (doplňková tabulka 4). Postupy pro nadměrnou expresi a purifikaci obou mutantů jsou totožné s postupy pro GyrB divokého typu E. coli popsanými výše v části Metody.
DNA supercoiling assay
Zvyšující se koncentrace DNA gyrázy (GyrA2B2) byla inkubována při 37 °C s 6 nM uvolněného plazmidu pUC19 v reakční směsi obsahující 20 mM Tris-acetát pH 7,9, 100 mM octan draselný, 10 mM octan hořečnatý, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA. Po 30 minutách byly reakce zastaveny přidáním 1% SDS. Elektroforéza v agarózovém gelu byla použita ke sledování přeměny uvolněného pUC19 na superzávitovou formu. Vzorky byly nanášeny na 0,8% agarózu, 1X Tris Borate EDTA buffer (TBE) gel, při 6 V/cm po dobu 180 min při pokojové teplotě. Agarosové gely byly obarveny 0,5 mg/ml ethidium bromidu v 1X TBE po dobu 15 min, poté následovalo 5 min odbarvování ve vodě. Topoizomery DNA byly odhaleny pomocí přístroje Typhoon (GE Healthcare).
Test aktivity ATP
Hydrolyzace ATP se měří sledováním oxidace NADH zprostředkované pyruvátkinázou (PK) a laktátdehydrogenázou (LDH). Absorbance byla sledována při 340 nm po dobu 600 s při 37 °C pomocí spektrofotometru Shimadzu 1700. Reakce byly zaznamenány ve třech opakováních s 50-100 nM GyrA2B2 a 16 nM lineární DNA (pCR-blunt) v 500 µl pufru obsahujícího 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM octan draselný, 8 mM octan hořečnatý, 7 mM BME, 100 µg/mg BSA, 4U/5U směsi PK/LDH, 2 mM PEP a 0.2 mM NADH.
Mnohočetné zarovnání a evoluční zachování zbytků
Sekvence proteinu GyrB ATPase/Transducer z 30 druhů (kódy Uniprot: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa, Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) byly zarovnány pomocí serveru Clustal Omega (EMBL-EBI). Následné zarovnání bylo použito k vykreslení evoluční konzervace aminokyselin na struktuře ATPázy/transduktoru (PDB ID 1EI1) pomocí serveru ConSurf (http://consurf.tau.ac.il). Fylogenetický strom byl vytvořen metodou spojování sousedů pomocí vícenásobného zarovnání v programu Clustal Omega.
Souhrn zpráv
Další informace o designu výzkumu jsou k dispozici ve zprávě Nature Research Reporting Summary spojené s tímto článkem.
.