APL nabízí služby nativní gelové analýzy od roku 1998. Dnes bohužel mnoho laboratoří tento cenný nástroj ignoruje, protože si myslí, že nativní gely jsou prostě příliš náročné na použití, nebo se mylně domnívají, že je lze použít pouze s kyselými proteiny. V Alliance Protein Laboratories běžně provádíme nativní gely jak u bazických, tak u kyselých proteinů. Rádi pro vás provedeme vzorky a/nebo s vámi budeme spolupracovat na vytvoření protokolu pro použití ve vaší laboratoři.
Co je to nativní gel?
„Nativní“ nebo „nedenaturující“ gelová elektroforéza probíhá za nepřítomnosti SDS. Zatímco u SDS-PAGE závisí elektroforetická pohyblivost proteinů především na jejich molekulové hmotnosti, u nativní PAGE závisí pohyblivost jak na náboji proteinu, tak na jeho hydrodynamické velikosti.
Elektrický náboj, který řídí elektroforézu, se řídí vlastním nábojem proteinu při pH běžícího pufru. Tento náboj bude samozřejmě záviset na aminokyselinovém složení proteinu a také na posttranslačních modifikacích, jako je přidání kyselin sialových.
Protože si protein zachovává svou složenou konformaci, jeho hydrodynamická velikost a pohyblivost na gelu se bude také lišit podle povahy této konformace (vyšší pohyblivost pro kompaktnější konformace, nižší pro větší struktury, jako jsou oligomery). Pokud se nativní PAGE provádí v blízkosti neutrálního pH, aby se zabránilo kyselé nebo zásadité denaturaci, pak ji lze použít ke studiu konformace, samoasociace nebo agregace a vazby jiných proteinů nebo sloučenin.
Nativní gely tak mohou být citlivé na jakýkoli proces, který mění náboj nebo konformaci proteinu. To z nich dělá vynikající nástroje pro detekci takových věcí, jako jsou:
-
změny náboje v důsledku chemické degradace (např. deamidace)
-
rozložené, „roztavené globule“ nebo jiné modifikované konformace
-
oligomery a agregáty (kovalentní i nekovalentní)
-
vazebné události (protein-protein nebo protein-ligand)
Tyto vlastnosti, a jejich relativně vysoká propustnost činí z nativních gelů vynikající nástroje pro analýzu vzorků se zrychlenou stabilitou, prokazování srovnatelnosti různých šarží nebo procesů nebo zkoumání účinků pomocných látek.
Další výhodou nativních gelů je, že po separaci je možné obnovit proteiny v jejich nativním stavu. Obnovení aktivních biologických materiálů však může být nutné provést před jakoukoli fixací nebo barvením.
Všimněte si, že nativní gely, o kterých se zde hovoří, se nyní někdy nazývají „čisté nativní“ gely. V principu se liší od takzvaných „modrých nativních“ gelů, které jsou závislé na vazbě barviva, které proteinu dodá velmi vysoký elektrický náboj, převyšující vlastní náboj polypeptidu. Pokud se předpokládá, že množství navázaného barviva je úměrné hmotnosti proteinu, pak lze pohyblivost pozorovanou pomocí tohoto „modrého nativního“ protokolu použít k odhadu molární hmotnosti porovnáním s proteinovými standardy, podobně jako se to dělá u SDS-PAGE. Hmotnostní standardy prodávané pro použití s modrými nativními gely nelze použít k odhadu molárních hmotností pro skutečné nativní gely, o kterých se zde hovoří.