Pozorování, že imunoneutralizace somatostatinu zvýšila bazální objem a produkci amylázy v modelu izolovaného krysího pankreatu, naznačuje intrapankreatický zdroj somatostatinu. Tento pankreatický somatostatin by tedy mohl způsobit tonickou inhibici exokrinní pankreatické sekrece (97). U potkanů při vědomí s žlučí a pankreatickým sekretem vráceným do střeva inhiboval i.v. somatostatin (5 µg kg-1 h-1) bazální pankreatickou sekreci proteinů a tekutin o 84, resp. 64 %; přidání atropinu ip (500 µg kg-1 h-1) další inhibici nezpůsobilo (51). U anestezovaných potkanů byla bazální sekrece amylázy významně inhibována infuzí somatostatinu v poměrně vysoké dávce 100 µg 100 g-1 h-1. Při podání bolusové injekce 50 µg 100 g-1 BW se však uvolňování amylázy zvýšilo čtyřnásobně po dobu 20 min (39). V předchozí studii (25) vedlo podání somatostatinu v dávkách 0,4 až 25 µg kg-1 h-1 potkanům s píštělí při vědomí k poklesu bazálního průtoku, uvolňování bikarbonátu a bílkovin v závislosti na dávce. Při nejvyšších dávkách se výdej bílkovin snížil o 80 %, bikarbonát o 63 % a průtok o 42 %. U potkanů v uretanové anestezii bylo v prvních dvou minutách pozorováno počáteční zvýšení všech pankreatických parametrů, po kterém následoval 30 až 40% pokles výdeje bílkovin. Za těchto podmínek musel somatostatin dosáhnout dávky 100 µg kg-1 h-1 , aby ovlivnil bazální uvolňování bikarbonátu. Tyto údaje o bazální pankreatické sekreci tekutin a proteinů naznačují, že inhibiční účinek somatostatinu se zdá být druhově specifický a citlivý na anestezii, jak se již dříve ukázalo (17). Při intraduodenální infuzi SS-14 potkanům v dávkách 12 až 96 µg kg-1 h-1 nebyly bazální výdej celkového objemu a bílkovin ovlivněny; tyto výsledky by mohly naznačovat, že luminální duodenální somatostatin neovlivňuje bazální pankreatickou sekreci přímo nebo prostřednictvím bazálního uvolňování CCK a sekretinu (126). Na rozdíl od potkana iv infuze SS-28 v dávce 400 ng kg-1 h-1 zcela inhibovala bazální sekreci tekutin a proteinů u psa při vědomí (147). Také u psů připravených s žaludeční a pankreatickou píštělí somatostatin-14 v dávce 2,5 µg kg-1 h-1 inhiboval bazální výdej objemu a bílkovin o více než 90 % (146).
U lidí byla stimulace pankreatu intraduodenálním podáním tryptofanu nebo směsi aminokyselin tlumena exogenním SS-28 (58). V jiných studiích u člověka inhiboval oktreotid postprandiální sekreci pankreatických enzymů (81). U psa způsobil SS-14 podaný ve formě iv bolusu v dávce 3,5 µg kg-1 a následné infuze v dávce 3,5 µg kg-1 h-1 významné snížení duodenální aktivity trypsinu a amylázy během stimulace testovacím jídlem (70). U potkanů oktreotid významně inhiboval objem pankreatu, bikarbonát, amylázu a sérové hladiny sekretinu a CCK v reakci na intraduodenální kyselinu olejovou, uvolňovač CCK (137).
U zdravých dobrovolníků (30) byla endoskopickou kanylací hlavního pankreatického vývodu získána čistá pankreatická šťáva. V reakci na syntetický sekretin (0,06 CU kg-1 h-1) dosáhla koncentrace bikarbonátu v pankreatické šťávě po 10 min hodnot 117 µEq ml-1 a průtok šťávy 7,3 ml/5 min po 15 min infuze sekretinu. SS-14 vedl ke snížení průtoku pankreatem o 47 % po 10 min a o 67 % po 15 min. Koncentrace bikarbonátu a bílkovin v pankreatické šťávě vykazovaly tendenci k poklesu pouze při dávce somatostatinu 5 µg kg-1 h-1. Také u lidí byla sekrece pankreatických enzymů, ale nikoliv bikarbonátu, stimulovaná sekretinem (250 ng kg-1/20 min) a kaeruleinem (25 ng kg-1/20 min) inhibována SMS 201-995 způsobem nezávislým na dávce (73). U psů při vědomí (147) byla sekrece tekutin a bikarbonátu stimulovaná sekretinem (1 CU kg-1 h-1) mírně ovlivněna většími dávkami SS-28 (400 ng kg-1 h-1). Při stejné dávce byl významně inhibován výdej bílkovin stimulovaný caeruleinem. U anestezovaných potkanů způsobil lineární somatostatin-14 podávaný v dávce 100 µg/100 g-1 h-1 silnou inhibici uvolňování pankreatické amylázy a trypsinu stimulovaného 3 IVY psl/100 g-1 h-1 CCK s rychlým obnovením těchto sekrecí po ukončení infuze somatostatinu (39). U potkanů při vědomí s odkloněnou pankreatickou šťávou (51), která způsobila silné zvýšení sekrece bílkovin a tekutin, všech pět dávek infundovaného oktreotidu (5,20,80,320 a 1280 ng kg-1 h-1) významně inhibovalo sekreci bílkovin i tekutin s IC50 40 a 60 ng kg-1 h-1 . Maximální inhibice proteinu a tekutin dosáhla 90 %, resp. 75 % při dávce 1,28 µg kg-1 h-1. SS-14 měl ve srovnání se svým analogem oktreotidem IC50 0,7 µg kg-1 h-1 pro sekreci bílkovin a 1,2 µg kg-1 h-1 pro sekreci tekutin, přičemž maximálního inhibičního účinku bylo dosaženo při dávce 25 µg kg-1 h-1 pro sekreci bílkovin i tekutin. Tyto údaje naznačují, že oktreotid je 20krát účinnější než SS-14 v inhibici pankreatické sekrece bílkovin a objemu stimulované odvedením pankreatické šťávy.
Studie in vitro
Pankreatická sekrece enzymů a tekutin in vivo je souhrnem mnoha komplexních fyziologických procesů, které zahrnují souhru endokrinních a parakrinních hormonů i stimulaci a uvolňování neurotransmiterů. Vzhledem k těmto mnohočetným interakcím je často obtížné posoudit, zda sloučenina, která inhibuje pankreatickou sekreci in vivo, ovlivňuje funkce acinárních a duktálních buněk přímo nebo mění uvolňování sekretagog. Proto izolovaný perfundovaný pankreas, izolované preparáty acinárních a duktálních buněk a buněčné kultury obou typů buněk mohou poskytnout odpovědi na některé z těchto otázek.
Acinární buňky pankreatu potkanů mají receptory specifické pro somatostatin-14 a 28 (124,166), které zůstávají přítomny i po přípravě buněk (40). Bylo také zjištěno, že v izolovaném perfundovaném psím pankreatu může žláza přijmout až 50-80 % perfundovaného somatostatinu v koncentračním rozmezí 20 až 4000 pg ml-1 ve srovnání s méně než 21 % inzulinu nebo glukagonu (71). Toto pozorování bylo později potvrzeno s extrakcí SS-14 psím pankreatem in situ v průměru více než 50 % ve srovnání s méně než 17 % u glukagonu (152). Všechna tato pozorování nám dovolují se domnívat, že somatostatin by měl být schopen inhibovat přímo nervově nebo hormonálně stimulovanou sekreci pankreatických enzymů in vitro pomocí výše citovaných buněčných preparátů.
I přes mnoho studií je inhibiční účinek SS-14 a SS-28 na stimulované uvolňování enzymů z izolovaných pankreatických acinů stále kontroverzní. K pochopení některých protichůdných výsledků může pomoci rozlišení mezi účinkem SS na stimulaci, kde agonista, jako je VIP, působí prostřednictvím cAMP, kde SS inhibuje, a agonisty, jako je CCK, kde někteří badatelé pozorovali inhibiční účinek a jiní ne. V perfundovaných acinech morčat byl kinetický profil uvolňování amylázy v reakci na VIP významně snížen SS (100 nM) (140). Na druhé straně oktreotid (100 nM) významně inhiboval synergické uvolňování amylázy stimulované sekretinem + CCK-8 nebo VIP + CCK-8 (65). Somatostatin také inhiboval účinek cAMP na kalciem indukovanou sekreci amylázy z akinů pankreatu potkana posunutím křivky dávka-odpověď doprava (99), což je další příklad působení SS prostřednictvím cAMP dráhy.
Mnoho dalších studií však jasně ukazuje, že somatostatin nemá žádné inhibiční účinky na exokrinní pankreas in vitro, ať už se jedná o izolovaný perfundovaný pankreas, izolované aciny nebo izolované preparáty lalůčků, u nichž byl podnětem CCK (65,96,99,139,158). V izolovaném krysím pankreatu (43) exogenní inzulin (10 mU ml-1) významně potencoval sekreci CCK a karbacholem stimulované amylázy, přičemž tato potenciace byla významně inhibována SS. Absence přímého inhibičního účinku SS byla pozorována také u izolovaných psích parietálních buněk (106). SS v koncentraci 1 µM totiž nedokázal inhibovat žaludeční sekreční odpověď na histamin, methacholin a pentagastrin, což podporuje některé výše uvedené údaje. Zajímavé je, že SS-28 ve vysoké koncentraci 10 µM dokázal stimulovat uvolňování amylasy z pankreatických acinů morčete na přibližně 68 % uvolňování stimulovaného 100 pM kaeruleinu. Maximální sekreční odpovědi shodné s odpovědí iniciovanou kaeruleinem bylo dosaženo také dvěma analogy SS-28, Nat S1-28 a SS28. Za těchto podmínek neměl SS-14 žádný stimulační účinek (33). Jako vysvětlení tohoto sekrečního účinku SS-28 na acini bylo navrženo, že SS-28 může ve vysokých koncentracích interagovat s CCK receptorem (34), přičemž tento účinek je inhibován DBcGMP, antagonistou CCK receptoru (105). Na druhé straně neschopnost SS-14 inhibovat stimulovanou sekreci enzymů z izolovaných acinů může mít za následek uvolnění aktivní proteázy, která byla poprvé pozorována ve vylučované pankreatické šťávě a která je schopna degradovat SS-14, do inkubačního média (127). Tato serinová proteáza byla purifikována do homogenity z čisté pankreatické šťávy potkanů. S MW přibližně 29 kDa odpovídá krysí pankreatické elastáze II. Pokud by se tedy vylučovala do inkubačního média, degradovala by SS-14 a zabránila by jakýmkoli jejím inhibičním účinkům, a tím by se částečně vysvětlilo, proč SS-14 nebyla schopna prokázat své inhibiční účinky na uvolňování enzymu in vitro (151). Může také ovlivnit sekreční odpověď na SS-28 při nižších koncentracích v inkubačním médiu. Další možností by mohlo být, že látky mobilizující vápník v buňkách snižují afinitu somatostatinových receptorů acinárních buněk k somatostatinu (33).
Vliv na růst
Normální růst organismu je výsledkem složité rovnováhy zúčastněných hormonů, jako je růstový hormon, inzulin a hormony štítné žlázy. Vzhledem k tomu, že somatostatin může inhibovat uvolňování mnoha hormonů, měla by jeho neutralizace stimulovat jejich sekreci a tím zvýšit růst. Tento přístup autoimunizace proti somatostatinu za účelem stimulace růstu byl testován u jehňat. Při získání významných titrů protilátek byla míra přírůstku hmotnosti u zvířat imunizovaných SS vyšší a doprovázená zvýšenou výškou. U těchto imunizovaných jehňat byla zaznamenána větší odpověď růstového hormonu na stimulaci argininem a také bazálně vyšší hladiny somatomedinu v krvi (143). Tyto údaje byly později potvrzeny i u tohoto druhu (75). Při podávání potkanům implantovaným subkutánně pomocí minipumpy Alzet neměl somatostatin podávaný v dávce 1,5 µg h-1 po dobu 14 dnů žádný vliv na jejich přírůstek hmotnosti. Infuze antagonisty somatostatinu však vedla k významnému zvýšení přírůstku hmotnosti oproti kontrole (144).
U potkanů neměla denní injekce somatostatinu-14 v dávce 390 µg kg-1 den-1 v želatině po dobu tří týdnů žádný vliv na tělesnou hmotnost, ale snížila hustotu parietálních a peptických buněk na krychlový milimetr ve srovnání s kontrolou. Antagonizoval však růst podporující účinek exogenního (130 µg kg-1 den-1) a endogenního uvolňování gastrinu po transpozici antra na tlusté střevo, což způsobilo hypergastrinémii. U těchto zvířat s transpozicí antra byla zvýšená hmotnost pankreatu významně snížena somatostatinem (400 µg kg-1 den-1) po dobu 3 týdnů (80). Po dobu 5 dnů somatostatin-14 s.c. v želatině v dávkách 11, 33 nebo 100 µg kg-1 každých 8 h způsobil významné snížení koncentrace pankreatické amylázy, chymotrypsinu a proteinu a celkového obsahu DNA pouze u dvou nejvyšších dávek bez vlivu na celkovou hmotnost pankreatu. Rychlost syntézy proteinů, RNA a DNA se však významně snížila bezprostředně po každé injekci somatostatinu po dobu 24 h (92). Somatostatin-14, podávaný rovněž s.c. v želatině v dávce 600 µg kg-1 třikrát denně po dobu 2 a 4 dnů, významně snížil trofické účinky kaeruleinu (1 µg kg-1 třikrát denně) se silným účinkem na celkový obsah DNA. Zajímavé je, že imunoneutralizace proti SS-14 významně zvýšila všechny studované růstové parametry nad hodnoty pozorované v reakci na caerulein (93). Podobné inhibiční účinky byly pozorovány při dlouhodobém podávání dlouhodobě působícího somatostatinu SMS 201-995 (54). Odvedení pankreatické šťávy u potkana způsobuje významné uvolnění endogenní CCK, což vede ke zvýšení růstu pankreatu (89). Při použití tohoto postupu odvedení žlučové a pankreatické šťávy vedla taková technika aplikovaná 8 h denně-1 po dobu 4 dnů k významnému zvýšení hmotnosti pankreatu a CCK v séru; oba účinky byly významně sníženy SMS 201-995 podávaným v dávce 5 µg kg-1 h-1 a L-364,718, antagonistou CCK-1 receptorů, podávaným v dávce 0,5 mg kg-1 h-1 . Za těchto podmínek byly SMS i L-364,718 ekvipotentní ve snižování růstu pankreatu, zatímco SMS byl jediným antagonistou schopným snížit na bazální úroveň endogenní CCK uvolňovanou pankreaticko-žlučovou diverzí (119). Tyto údaje naznačují, že somatostatin a jeho analoga mohou snížit růst pankreatu stimulovaný exogenní a endogenně uvolněnou CCK. Nakonec bylo zjištěno, že somatostatin (SMS) podávaný rychlostí 5 µg kg-1 h-1 po dobu 2 dnů dokázal zcela zabránit 70% zvýšení hmotnosti pankreatu a obsahu celkové RNA a DNA vyvolanému kaseinem (94). To je další důkaz, že somatostatin může kontrolovat indukovaný růst pankreatu stimulovaný endogenní CCK uvolňovanou stravou bohatou na bílkoviny (50). SMS 201-995 podávaný samostatně jako i.v. infuze po dobu 7 dní v dávce 5 µg kg-1 h-1 způsobil významné snížení hmotnosti pankreatu a střeva doprovázené snížením celkové DNA a RNA v obou orgánech. Plazmatický CCK a IGF-1 byly sníženy, zatímco celkový obsah IGF-1 v pankreatu byl zvýšen (120). Kromě endogenního CCK některá pozorování naznačují možnou účast IGF-1 v procesu pozitivní regulace růstu ve střevě a pankreatu. Tento růstový faktor je totiž přítomen ve střevě (28) a pankreatu (56) a na buňkách těchto orgánů byly dokumentovány specifické receptory (76,162); byly postulovány parakrinní nebo autokrinní mechanismy působení (29). Somatostatin může působit na řízení těchto dvou orgánů prostřednictvím inhibice uvolňování IGF-1 doprovázené podobným účinkem na střevní CCK.
Účinky somatostatinu na nádory slinivky břišní
Somatostatin byl charakterizován jako „univerzální vypínač“, protože inhibuje většinu orgánových a buněčných funkcí, se kterými byl spojován. Úloha somatostatinu a jeho analogů v léčbě rakoviny slinivky byla navržena, protože tyto molekuly zpočátku poskytovaly pozitivní netoxickou adjuvantní léčbu.
U zlatého syrského křečka, kterému byly subkutánně implantovány buňky duktálního adenokarcinomu pankreatu WD, snížila 21denní chronická léčba analogem somatostatinu (L-5-Br-Trp8)SS v dávce 20 µg b.i.d. hmotnost nádoru o 44 % a objem nádoru o 22 % (114). Bylo také prokázáno, že somatostatin a jeho analog RC-160 inhibují preneoplastické změny a snižují výskyt nádorů u křečků vystavených karcinogenu pankreatu BOP; tato léčba způsobila zvýšení počtu apoptotických nádorových buněk (150). V jiné studii se po léčbě RC-160 zvýšil počet somatostatinových receptorů na nádorových buňkách (35). Růst buněk MIAPaCa-2 implantovaných s.c. do nahých myší byl v závislosti na dávce inhibován injekcemi oktreotidu dvakrát denně v dávkách 250 a 2500 µg kg-1 (160). Při použití jiného způsobu podání léčiva, mikrokapslí, RC-160 podávaný v dávce 1250 µg kg-1 d-1 významně inhiboval růst nádorů MIAPaCa-2 u nahých myší (110). Neúspěch somatostatinu nebo jeho analogů při inhibici růstu nádorů mohl být způsoben absencí SS receptoru, jak se ukázalo u lidských buněk karcinomu pankreatu PGER, které nereagují na SMS 201-995 (141). U buněk MIAPaCa-2 a PANC-1 pěstovaných v DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum inhibovaly 1 µM SS-14 a SMS 201-995 růst buněk PANC-1 s aktivací tyrozinfosfatázy SHP-1. V případě, že SS-14 a SMS 201-995 byly v DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum, inhibovaly růst buněk PANC-1 s aktivací tyrozinfosfatázy SHP-1. SS a jeho analog naopak způsobily růst buněk MIAPaCa-2 a tento růstový efekt mohl být důsledkem nepřítomnosti SHP-1 v těchto buňkách (31). V buňkách reagujících na somatostatin bylo již dříve prokázáno, že SHP-1 se purifikuje společně se somatostatinovým receptorem (167). Podobný růst stimulující účinek SMS byl pozorován u buněk BON (lidské pankreatické karcinoidní buňky) v dávce 1 nM a 100 nM; tento růstový účinek byl doprovázen významným snížením obsahu cAMP v buňkách bez ovlivnění hydrolýzy PI (66).
Většina klinických studií analogů somatostatinu v adjuvantní léčbě karcinomu pankreatu neprokázala odpověď. U 14 pacientů s metastazujícím karcinomem pankreatu nebyl pozorován žádný protinádorový účinek při podávání tří denních s.c. injekcí 100-200 µg SMS po dobu 7 týdnů (72). V jiné studii byl devatenácti pacientům s pokročilým exokrinním karcinomem pankreatu podáván analog somatostatinu BIM23014 v dávce 250 µg až 1 mg den-1 po dobu 2 měsíců. V rámci této skupiny měl jeden pacient částečnou odpověď, šest mělo stabilní onemocnění a jedenáct mělo progresivní onemocnění (20). Ze studií provedených na různých buňkách karcinomu pankreatu a různých dosažených odpovědí na jejich růst se zdá, že jedním z klíčů k úspěchu v rozhodujícím boji proti karcinomu pankreatu je exprese specifických somatostatinových receptorů a použití specifického analogu (37). Vlastnosti pěti klonovaných podtypů lidských somatostatinových receptorů a stanovené, pravděpodobné a nestanovené indikace pro použití somatostatinových analogů byly shrnuty v odkazu 77.
Klinické použití somatostatinu
Klinicky byl oktreotid použit při léčbě akutní pankreatitidy, ale nebyl potvrzen jednoznačný přínos. V jedné studii (111) byl somatostatin podáván v počáteční bolusové dávce 250 µg a následně 250 µg h-1 jako kontinuální infuze; léčba u 9 z 12 pacientů s akutní pankreatitidou zvrátila amylasemii a přinesla klinické zlepšení, ale neprokázala snížení mortality. Somatostatin však zůstává účinnou léčbou zavedených lokálních komplikací akutní pankreatitidy, jako jsou pankreatické píštěle a pseudocysty (112). V jedné studii byli pacienti s metastazujícími endokrinními nádory pankreatu zpočátku léčeni oktreotidem v dávce 50 µg s.c. každých 12 h a později (6-16 měsíců) byla dávka zvýšena na 500 µg každých 8 h. Někteří pacienti na léčbu nereagovali, zatímco u jiných byla účinná; příznaky se zlepšily, ale nakonec se znovu objevily a všichni pacienti zemřeli, jakmile bylo dosaženo fáze rezistence jejich onemocnění (163). Tyto údaje naznačují, že somatostatin není ideální léčbou pankreatitidy, ale může být užitečný k léčbě lokálních komplikací onemocnění. Bylo však prokázáno, že SMS je velmi účinný při odstraňování pankreatického průjmu a umožňuje korekci dehydratace a acidózy. Jeho účinek vedl k výraznému snížení plazmatických koncentrací VIP (84).
3. Nástroje pro studium somatostatinu
a) Peptid
Somatostatin-14 a -28 jsou komerčně dostupné. Hlavním agonistou používaným in vivo je oktreotid (SMS 201-995) a dalšími jsou: RC-160, BIM-23014, BIM-23056, BIM-23027 a L-362,855. Z řady BIM působí BIM-23056 jako agonista na receptor SST-3 i jako antagonista na receptor SST-5 (161). Chemické struktury těchto molekul jsou uvedeny v tabulce 1.
b) Protilátky a testy
Protilátky proti somatostatinu -14, -28, SMS 201-995 a RC-160 byly vyvinuty v mnoha laboratořích. Jako příklad lze uvést Guilleminovu RIA s použitím ovčího antiséra BARBAR-78; toto antisérum bylo vzneseno proti syntetickému SS-14 a zkříženě reaguje se syntetickým ovčím SS-28 v ekvimolárním poměru (15). Bylo rovněž vyvinuto specifické antisérum proti SS-28 (67) a byly rovněž stanoveny RIA pro SMS 201-995 (5) a RC-160 (83).
c) Experimentální modely
Většina fyziologických studií provedených na lidech byla provedena na zdravých dobrovolnících a dobrovolnicích (30). Z experimentálních zvířat byly studie většinou prováděny na psech při vědomí s žaludeční a pankreatickou píštělí (146,147), na potkanech při vědomí s odvedenou žlučopankreatickou šťávou (25,127) a na anestetizovaných potkanech (39). Pro zjištění chronického účinku somatostatinu na pankreas byly potkanům denně podávány s.c. injekce somatostatinu (92). Studie in vitro byly obvykle prováděny s čerstvě připravenými pankreatickými aciny, izolovanými laloky nebo izolovanou perfundovanou slinivkou z potkana, myši nebo morčete (65, 96,139,158). V tabulce 2 jsou uvedeny některé údaje o použitých zvířecích druzích, dávkách nebo koncentracích podaného somatostatinu a analogů a jejich účincích
.