KOMENTÁŘ
Vyloučení barviva je jednoduchá a rychlá technika měření životaschopnosti buněk, ale naráží na problém, že životaschopnost se určuje nepřímo z integrity buněčné membrány. Je tedy možné, že životaschopnost buňky může být narušena (měřeno schopností růstu nebo funkce), přestože integrita její membrány je (alespoň přechodně) zachována. A naopak, integrita buněčné membrány může být abnormální, ale buňka může být schopna se opravit a stát se plně životaschopnou. Dalším potenciálním problémem je, že vzhledem k subjektivnímu hodnocení příjmu barviva může malé množství příjmu barviva svědčící o poškození buňky zůstat nepovšimnuto. V tomto ohledu vylučování barviva prováděné s fluorescenčním barvivem pomocí fluorescenčního mikroskopu běžně vede k vyhodnocení většího počtu neživých buněk s vychytáváním barviva než testy prováděné s trypanovou modří pomocí transmisního mikroskopu.
Složitější metodou měření životaschopnosti buněk je stanovení vylučování barviva pomocí průtokové cytometrie. To lze provést pomocí trypanové modři, protože tento protein se váže na bílkoviny a poté vyzařuje fluorescenční signál, který lze detekovat v průtokovém cytometru (při vlnové délce 660 nm, pokud se váže na hovězí sérový albumin) (podrobnosti o použití trypanové modři v průtokové cytometrii viz odkaz 2). Alternativně lze vyloučení měřit pomocí jiných barviv emitujících světlo, jako je propidium jodid (popis použití propidium jodidu pro hodnocení životaschopnosti buněk pomocí průtokové cytometrie viz kapitola 5.4). Podrobné porovnání odhadů živých a mrtvých buněk pomocí vyloučení trypanové modři vyhodnocených ručně, jak je popsáno zde, a vyhodnocených elektronicky pomocí průtokové cytometrie ukazuje, že obě techniky poskytují ve zkušených rukou velmi podobné výsledky. Zatímco u popsané techniky vylučování barviva je větší pravděpodobnost, že dojde k chybě kvůli subjektivitě obsluhy, průtoková cytometrie je méně vhodná pro hodnocení životaschopnosti buněk při provádění složitých a časově náročných technik čištění buněk. Průtoková cytometrická technika je tedy použitelná pouze tehdy, když je třeba získat přesná měření počtu mrtvých buněk ve směsi buněk.
Nedávno byl popsán „automatizovaný test životaschopnosti pomocí fluorescenčního mikroskopu“, při kterém se životaschopnost buněk ověřuje pomocí propidium jodidu ve spojení se zařízením, které počítá živé a mrtvé buňky v přenosném mikročítači buněk mikroskopu vybaveném mikročipem. Toto počítadlo je údajně schopno posoudit životaschopnost buněk rychleji než zde popsaná manuální technika nebo průtokový cytometr a získat přesnější a spolehlivější počty. Toto zařízení může být užitečné v situacích, kdy je zapotřebí mnoho rychle získaných testů životaschopnosti buněk (3).
Je třeba poznamenat, že životaschopnost buněk lze hodnotit také pomocí barviv, která se vážou na DNA (ethidium monoazid), látek, které se vážou na fosfatidylserin (Annexin V), a aminoreaktivních barviv. Použití těchto alternativních činidel obvykle vyžaduje průtokovou cytometrii, a je proto použitelné pouze za zvláštních podmínek.
Vyloučení trypanové modři, jak je popsáno ve výše uvedeném protokolu, lze provést za 5 až 10 min.
.