PMC

Prezentace případu

Předkládaná kazuistika pochází z rutinní veterinární návštěvy farmy se 155 zvířaty, kde se chovají dvě plemena ovcí (Pelifolk a Blackbelly), která se nachází v Tesistánu, obec Zapopan, stát Jalisco, Mexiko. Zařízení této farmy bylo adaptováno z předchozího chovu prasat a je stále obklopeno chovy prasat a skotu v blízkém okolí. Stádo bylo chováno na vyvýšených podlahách, aby se usnadnilo čištění a manipulace, nicméně v kotcích se nacházelo mnoho opečených ostrých předmětů (např. dráty, rozbité ploty, hřebíky atd.) a v době kontroly se na farmě neprovádělo řádné čištění. Krmení bylo založeno na místně dostupných krmivech, jako je nekvalitní objemné krmivo, siláž z prasečího hnoje a komerční krmný koncentrát s vysokým obsahem bílkovin. Tato farma přivolala veterinární službu kvůli častým kožním abscesům zjištěným u zvířat, žádné další stížnosti související s kožními problémy nebyly hlášeny. Zdálo se, že abscesy nemají vliv na užitkovost zvířat, nicméně přítomnost těchto lézí negativně ovlivňuje odbyt zvířat, a proto měl majitel zájem zjistit etiologický agens a doporučenou léčbu k odstranění onemocnění z farmy. Obsah abscesů byl certifikovaným veterinárním lékařem odebrán z 31 zvířat (29 bahnic, 1 beran a 1 jehně) a odeslán do laboratoře k bakteriologické diagnostice s cílem zjistit etiologické agens, které problém způsobovalo. Na základě vzhledu abscesů byla předpokládanou diagnózou infekce v chovu u většiny zvířat kaseózní lymfadenitida . Bakteriologická analýza však prokázala, že 13 zvířat bylo infikováno C. pseudotuberculosis, 1 Corynebacterium spp., 2 Proteus spp., 2 Streptococcus spp. a ve zbývajících 13 případech se patogen nepodařilo identifikovat. Kategorizace izolátu Corynebacterium spp. byla nejasná, protože výsledky bakteriologických a biochemických testů nebyly závěrečné.

Tento článek popisuje izolaci C. xerosis ze 4měsíčního jehněte plemene Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) v dobré tělesné kondici. Podle našich znalostí se jedná o první zprávu o C. xerosis vyvolávající klinický kožní absces u ovcí. Od majitele zvířete byl získán informovaný souhlas se zveřejněním výsledků klinické studie včetně fotografického materiálu. Zvíře vykazovalo absces tvrdé konzistence bez drenáže na levé straně krku (obr. 1a). Počáteční klinická diagnóza naznačovala kaseózní lymfadenitidu, pravděpodobně způsobenou C.pseudotuberculosis. Vzorek pro bakteriologickou analýzu byl získán punkcí abscesu sterilní injekční stříkačkou o objemu 5 ml podkožní jehlou o průměru 20 mm po očištění a dezinfekci povrchu abscesu. Typ získaného exsudátu byl serózní a bílého vzhledu. Biologický vzorek byl uchováván při 4 °C až do biologické charakterizace v Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 silnice Toluca-Atlacomulco, Toluca, Mexiko, z.c. 50200). Doba mezi odběrem a zpracováním vzorku nepřesáhla 72 h. Vzorek byl kultivován ve dvou opakováních v 8 % agaru z ovčí krve a inkubován 24-48 h při 37 °C v aerobních a mikroaerofilních podmínkách. Byly pozorovány kolonie o průměru 1,0 mm, nehemolytické, žlutohnědé barvy a mírně suchého vzhledu (obr. 2a). Tyto morfologické charakteristiky neodpovídaly těm, které byly dříve popsány pro C. pseudotuberculosis, ale spíše se jevily jako kolonie z C. xerosis . Mikroskopicky (zvětšení 10×; obr. 2c) byly bakterie pozorovány jako kyjovitě zakončené, pleomorfní, nepravidelně zbarvené grampozitivní tyčinky. Biochemické testy ukázaly následující výsledky: Triple sugar Iron (TSI,-), Lysine Iron agar (LIA,-), Citrate test (CIT,-), Sulphide Indole-Motility (SIM,-), Motility, Indole, Ornitine (MIO,-), Oxidative-fermentative (OF,-) Methyl red (-), Peptonová voda (-), Voger Pascaguer (-), Močovina (-), Nitrátový bujón (+), Trehalóza (+), Sacharóza (+), Maltóza (+) a Glukózová fermentace (pozitivní při 37 °C a negativní při 42 °C). Tyto výsledky by mohly odpovídat profilu C. pseudotuberculosis, s výjimkou testu na močovinu, který byl negativní místo pozitivního, a proto se lépe shodoval s profilem C. xerosis . Diagnostické výsledky nebyly průkazné, a proto, i když systém API není specifický pro identifikaci C. xerosis , jsme se rozhodli izolát tímto systémem prozkoumat, abychom zjistili, zda by tento izolát mohl být identifikován jako jiný druh Corynebacterium. Dále, abychom zjistili, zda tento izolát patří k jiným druhům, jako jsou C. freneyi a C. amycolatum, které se u ovcí vyskytují zřídka, jsme testovali, zda je kolonie schopna růst při 20 °C a zda je schopna fermentovat glukózu při 42 °C. Izolát rostl dobře při 20 °C a nefermentoval glukózu při 42 °C, což jsou charakteristiky spojené s C. xerosis a C. hansenii , proto jsme se rozhodli provést molekulární analýzu, abychom zjistili, zda můžeme izolát molekulárně identifikovat jako C. xerosis. Pro zvýšení diagnostické přesnosti jsme analyzovali tři lokusy. Testovali jsme gen, který obvykle chybí u C. xerosis, ale je přítomen u C. pseudotuberculosis, gen pld, u kterého jsme očekávali, že po PCR testu nenajdeme žádný amplikon, pokud by izolát byl C. xerosis na rozdíl od C. pseudotuberculosis, který bude amplifikovat pás 203 bp; druhý lokus byl zaměřen na amplifikaci intergenní spacerové oblasti genů 16S-23S rRNA (16S-23S) s použitím primerů určených pro C. pseudotuberculosis, které podle zpráv nefungují pro C. xerosis , a také bychom neočekávali žádný amplifikační pás pro C. xerosis a pás 816 bp pro C. pseudotuberculosis. Nakonec jsme provedli PCR amplifikaci a sekvenování genu rpoB (446 bp), který byl již dříve popsán pro rozlišení druhů Corynebacterium . Extrakce DNA byla provedena pomocí komerční soupravy (KAPA Express Extract) podle protokolu výrobce. Technika multiplex-PCR pro amplifikaci dílčích sekvencí genů pld, 16S-23S a rpoB byla provedena podle protokolu publikovaného Pachecem v roce 2007 . Reakce byly provedeny pomocí komerční soupravy pro multiplexní PCR (QIAGEN Multiplex PCR) podle specifikací výrobce. Analýza PCR zahrnovala následující vzorky: Pseudotuberculosis (jeden místní izolát dříve charakterizovaný jako biovar ovis a referenční kmen ATCC 43924, biovar equi), které byly použity jako kontroly. Jak se očekávalo pro domnělou C. xerosis, byl amplifikován jediný amplikonový pás PCR 446 bp, odpovídající fragmentu genu rpoB, a fragmenty intergenního genu 16S-23S a genu pld nebyly amplifikovány. Rovněž podle očekávání vykazovaly oba kmeny C. pseudotuberculosis tři pásy o délce 203, 446 a 816 bp, odpovídající genům pld, rpoB a 16S (obr. 3). Amplikony genu RpoB všech tří vzorků byly přečištěny pomocí purifikační soupravy Promega (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) a byly odeslány k automatickému sekvenování společností Macrogen (Rockville, MD, USA). Vícenásobná zarovnání sekvencí získaná z BLAST (NCBI) byla analyzována spolu se sekvencemi našich izolátů pomocí analýzy Clustal W z programu Mega 6.0.6 (obr. 4). Fylogenetická analýza byla provedena pomocí metody sousedského spojování (software MEGA 6.0.6). Hodnoty Bootstrapu byly získány vygenerováním 1000 náhodných stromů. Do fylogenetické analýzy byly zahrnuty také sekvence genu rpoB z C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) a C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). Bylo možné pozorovat různé fylogenetické skupiny, které odpovídaly jednotlivým druhům korynebakterií. Tyto výsledky, potvrzují, že izolát této studie (rpoB C53) je C. xerosis (obr. 4).

Genotypizační techniky, jako je PCR, stejně jako sekvenční analýza izolátu rpoB C53 v této studii významně přispěly ke správné identifikaci druhu, která byla původně při použití fenotypových mikroskopických a biochemických znaků zavádějící. Corynebacterium xerosis bylo dříve zaznamenáno v klinických vzorcích lidských případů v lézích při endokarditidě, pneumonitidě, osteomyelitidě a kožních infekcích, zejména u imunokompromitovaných pacientů . Byla také nalezena v klinických vzorcích zvířat, například v lézích na kozích játrech (podezření na pseudotuberkulózu) a v kravském mléce od zvířat s mastitidou. U prasat byla C. xerosis izolována z lézí v různých tkáních, jako jsou játra, ledviny, plíce, slezina, klouby, a také z podkožního abscesu. Kromě toho byla C. xerosis izolována z klinických vzorků dělohy ovcí v případě potratu a z plicní tkáně zvířat s dýchacími problémy. Tyto izoláty byly identifikovány a charakterizovány amplifikací genu rRNA 16S-23S pomocí PCR-RFLP. V těchto studiích však nebylo možné získat dostatečně jasný vzor pásů, aby bylo možné odlišit C. xerosis od jiných druhů Corynebacterium. Autoři také provedli analýzu a porovnání sekvencí genů 16S a rpoB, což jim umožnilo odlišit C. xerosis od jiných druhů, geneticky podobných Corynebacterium .

Jak bylo uvedeno výše, tato studie byla provedena na základě přítomnosti genu rpoB, který byl jinými autory uváděn jako gen volby pro fylogenetickou analýzu rodu Corynebacterium, protože vykazuje vysoký polymorfismus, dokonce větší než intergenní spacerová oblast genů 16S-23S rRNA . Je známo, že kožní abscesy u ovcí (kaseózní lymfadenitida) způsobuje C. pseudotuberculosis a jejím hlavním faktorem virulence a patogenity je exotoxin fosfolipáza D, kódovaný genem pld a exprimovaný v buněčné membráně bakterie . Tento exotoxin je faktorem propustnosti, který podporuje hydrolýzu esterových vazeb ve sfingomyelinu v buněčných membránách savců, což pravděpodobně přispívá k šíření bakterií z počátečního místa infekce do sekundárních míst přes lymfatický systém do regionálních ganglií, a zřejmě se podílí na snížení životaschopnosti makrofágů po infekci . Exotoxin rovněž způsobuje dermonekrotické léze . Tento exotoxin však nebyl u C. xerosis popsán jako patogenní toxin, který by mohl přispívat ke vzniku abscesů. To zdůrazňuje význam provádění dalšího výzkumu týkajícího se mechanismů infekce přítomných u tohoto druhu Corynebacterium.

Důležitým bodem diskuse epidemiologické povahy je mimo jiné skutečnost, že výrobní systém ovcí, z něhož byl vzorek získán, byl dříve používán pro prasata, tedy druh, u něhož byla C. xerosis hlášena jako běžný patogen . Kromě toho jsou jednou z hlavních složek stravy ovcí vedlejší produkty prasat (prasečí hnůj – siláž), které by případně mohly obsahovat aktivní patogeny, možná včetně Corynebacterium spp. Kromě toho jsou v zařízeních rozšířeny ostré předměty, jako jsou kovové tyče, hřebíky a dráty, které zvyšují možnost poranění zvířat, což otevírá cestu vstupu Corynebacterium spp. do organismu, včetně C. xerosis. Všechny tyto faktory mohly přispět k výskytu C. xerosis uvnitř zařízení. Žádné další studie nebyly provedeny, nicméně doporučení pro majitele bylo odstranit abscesy a dezinfikovat je u všech zvířat v prostoru s výskytem infekce (aby se zabránilo šíření patogenů), posílit čištění kotců a odstranit všechny ostré hrany a předměty z ohrad, krmítek a podlah. Vzhledem k tomu, že C. xerosis, stejně jako C. pseudotuberculosis, jsou potenciálně zoonotické mikroorganismy, byla chovateli doporučena extrémní opatření při manipulaci se zvířaty a odpadem produkovaným farmou, aby se zabránilo infekci lidí a zvířat a možnému rozšíření mikroorganismu do dalších farem.

.