Je asi jen málo čtenářů, kterým jméno Barbara McClintock nic neříká. Zatímco všichni laureáti Nobelovy ceny získávají široké uznání, v jejím případě to bylo umocněno těžkým bojem, kterému čelila za přijetí své práce. Cytogenetička, která pracovala na kukuřici jako na modelovém systému, došla k závěru, že ne všechny geny jsou statické pevné lokusy na definovaných místech genomu. Říci, že její závěr, že existují „skákající geny“ – kódující elementy DNA schopné přesouvat se z jednoho chromozomálního místa na druhé – se setkal s obecnou nedůvěrou, je slušně řečeno slabé slovo. Čas a množství dat jí daly za pravdu a její Nobelova cena za fyziologii nebo medicínu z roku 1983, kdy jí bylo 81 let, byla stejně tak důkazem její vytrvalosti jako dobré vědy.
Prvky DNA, které objevila, se správně označují jako transponovatelné elementy nebo transpozony. Strukturálně sdílejí řadu rysů podobných některým typům virů (retrovirům) a lze je svým způsobem považovat za obdobu viru v tom smyslu, že se mohou poloautonomně replikovat s využitím strojů hostitelské buňky. Na rozdíl od pravých virů však transpozony neopouštějí buňku a potomci se jednoduše přesunou na nové genomové místo, kde se usídlí. Jsou v podstatě nejjednodušším příkladem takzvaného „sobeckého genu“, což je postulát, že genetické prvky se snaží pouze replikovat samy sebe. Zatímco většina z nich se k tomu „rozhodla“ prostřednictvím kooperativního spojení s jinými geny, aby vytvořila životaschopné replikující se organismy, transpozony tak činí čistě samy za sebe a spíše jako parazit na hostitelské buňce než jako produktivní součást většího celku. Náš dnešní zájem o ně pramení jednak ze skutečnosti, že se neomezují pouze na existenci v kukuřici, ale ve skutečnosti se vyskytují ve většině organismů včetně člověka, a jednak s ohledem na tento darebácký, každému genu vlastní vnitrobuněčný způsob života.
LINES a SINES
Lidé nemají jen jeden typ transpozonů – ve skutečnosti existuje řada typů, které se volně dělí podle fyzické velikosti na dlouhé prokládané elementy (LINES) a krátké prokládané elementy (SINES). Jak se dalo očekávat, čím větší jsou fyzicky, tím více genetické informace mohou kódovat. Ten známý jako LINE-1 o velikosti ~6000 párů bází kóduje dva otevřené čtecí rámce (oblasti, které mohou být přepsány do mRNA a poté přeloženy do proteinu). Jeden z těchto proteinů má vazebnou aktivitu na RNA, ale nejasnou biologickou funkci; druhý má endonukleázu (stříhání DNA) a reverzní transkripci (generování sekvencí DNA na základě RNA templátů). V podstatě po přepisu elementu LINE-1 (částečně řízeném vazebnými místy transkripčních faktorů na jeho 5′ konci) exprimovaný druhý protein provádí řezy v hostitelské DNA prostřednictvím své endonukleázové funkce. Poté vytvoří kopii DNA celého transkriptu LINE-1 prostřednictvím své funkce reverzní transkriptázy. Tato kopie DNA se vloží do vystřiženého hostitelského genomu a opravné mechanismy hostitelské buňky ji naváží na místo. Hostitelský chromozom nyní získal novou kopii LINE-1 a každý následující buněčný replikační cyklus ji replikuje jako součást své „normální, vrozené“ jaderné DNA. To se považuje za autonomní retrotranspozici, protože LINE-1 dodává pro tento proces své vlastní klíčové enzymové funkce. Ačkoli k samotnému procesu dochází zřídka, je snadné si představit, jak v dlouhých biologických časových horizontech může vést k nahromadění vícenásobných replikačních kopií elementu LINE-1. LINE-1 je považován za jediný plně autonomní transponovatelný element lidského genomu a ukázal se jako účinná biologická strategie, neboť téměř 17 % lidského genomu je tvořeno touto sekvencí (zhruba 170 000 kopií na buňku)!“
Naše dnešní pozornost se však soustředí na SINE, a to zejména na jeden (ve skutečnosti jednu rodinu) známý jako Alu elementy. Jsou pojmenovány podle restrikčního endonukleázového místa (Alu I), které charakteristicky obsahují, a jsou mnohem kratší než LINE-1, jen asi 280 párů bází dlouhé. To znamená, že nemají velkou vlastní kódovací kapacitu kromě některých startovacích signálů transkripce, a nejsou tedy autonomní. Ve skutečnosti Alu elementy vyžadují ke své replikaci jak buněčné faktory, tak druhý proteinový produkt LINE-1, a jsou tak v jistém smyslu parazitické jak vůči hostitelské buňce, tak vůči elementům LINE-1. Tento přístup parazita parazita je zřejmě ještě účinnější strategií sobeckých genů, protože Alu elementy tvoří asi 11 % lidského genomu (asi 2 miliony kopií na buňku).
Biologické dopady
Není překvapivé, že existuje několik velmi reálných dopadů toho, že máme v genomu tolik genetických darmožroutů – a navíc nestabilních. Zejména prostřednictvím transkripčních a jiných genetických signálů, které nesou, může Alu element ovlivňovat mnoho aspektů exprese proximálního hostitelského genu, včetně úrovně základní genové exprese, sestřihu intronů a polyadenylace a editace RNA. Evoluční tlak na buňku jako celek by obecně vedl k adaptaci hostitelského genomu, aby se přizpůsobil, kompenzoval nebo možná v některých případech dokonce získal výhodu z vlivu konkrétního Alu elementu v kontextu. Takové adaptace hostitele však trvají dlouho a klinické patologie mohou vzniknout, když dojde k nové transpozici Alu, která vede k náhlé genetické změně na v podstatě náhodném lokusu – vložení nové kopie Alu.
Několik věcí, které je třeba o tom vědět, je, že jelikož se jedná o proces replikace iniciovaný transkripcí (RNA), je replikace náchylná k chybám. Na rozdíl od polymeráz DNA, z nichž mnohé obsahují tzv. funkci proofreadingu, kdy každý nukleotid přidaný do vznikající kopie templátu je podroben druhému pohledu, aby se potvrdila skutečná komplementární shoda na rozdíl od shody založené na přechodném tautomerním posunu, jsou polymerázy RNA biologicky optimalizovány pro rychlost a procesivitu. Jakmile je do rostoucího transkriptu přidán nukleotid, polymeráza spěchá vpřed k další bázi. Protože část všech bází tvořících DNA a RNA může existovat a existuje v tautomerních formách, kde dochází ke krátkodobým přeskupením vodíků a dvojných vazeb ve srovnání s formami, které vidíme v učebnicích, mají transkripty RNA tendenci mít nízkou, ale významnou míru chybného kopírování ze své předlohy DNA.
Cítím, že někteří čtenáři najednou panikaří, proč když je to tak, nemáme všichni nepořádek kvůli chybám v běžných transkriptech mRNA? Je to proto, že vytváříme více kopií transkriptů z aktivních genů a v průměru jsou v pořádku. Ať už jsou v pořádku, nebo ne, mají krátkou životnost, než dojde k jejich degradaci a nahrazení novými transkripty podle potřeby. Vzácné ojedinělé chyby v mRNA tedy pravděpodobně nebudou mít význam.
Jestliže však nyní vezmete tuto ne zcela dokonalou RNA kopii DNA a poté ji zpětně přepisujete do DNA za účelem dlouhodobého šíření, opravili jste nyní tuto genetickou změnu na dlouhou dobu. Důsledkem toho je, že pouze malá část Alu elementů v našich genech je skutečně schopna se replikovat a vkládat nové kopie sebe sama. Celkově se odhaduje, že existuje jen asi jedna nová Alu inzerce. To je velmi dobře, protože tyto inzerce jsou potenciálně problematické.
Připomeňme si, že asi jedno procento nebo o něco více lidského genomu kóduje hostitelské proteiny (zhruba 21 000 genů). Pokud se pustíme do vytváření řezů a svévolného cpaní nepříbuzné DNA do genomu, je logické, že přibližně jedno procento z nich bude v genech a výsledkem bude inserční inaktivace genu. Protože Alu element nese transkripční signály a potenciálně i další regulační prvky, je také docela dobře možné, že bude mít nežádoucí vliv na expresi genů, u kterých je pouze v blízkosti. V obou případech je výsledkem dysregulace genu nebo genů, téměř jistě se škodlivými následky.
Jinak na okraj, přesně tento postup se používá u některých modelových organismů k identifikaci genů vztahujících se k fenotypovému znaku. Zjednodušeně lze říci, že transpozony endogenní pro daný organismus lze podnítit k aktivaci a u potomstva organismů se změnami fenotypu, který je předmětem zájmu, se zkoumají případná nová místa vložení transpozonů za předpokladu, že se mohou nacházet v genech souvisejících s fenotypem nebo v jejich blízkosti. Tomuto postupu se říká označování transpozonů.
Kromě nových retrotranspozičních událostí způsobujících inserční inaktivaci může vysoký celkový počet Alu elementů sám o sobě vést k dalším genetickým problémům. Konkrétně tyto lokální ostrůvky sekvenční podobnosti mohou být body pro nerovnoměrné homologní rekombinační události, kdy chromozomální kontext kolem každého Alu elementu není stejný. K těm může docházet jak extrachromozomálně (což vede k výměně nehomologních chromozomálních segmentů), tak intrachromozomálně (kde mají tendenci vést k deleci nebo duplikaci oblastí v závislosti na tom, zda jsou oba Alu elementy ve stejné nebo opačné polaritě orientace).
Příklady z reálného života
Takže teď, když jsme probrali teorii, že u lidí skutečně existují mobilní genetické elementy, které se někdy aktivují a vkládají nové kopie sebe sama, což může mít pro buňku neblahé důsledky – co příklady z reálného života? Objevují se v klinickém prostředí lidé s problémy, které lze přičíst novým vložením Alu? Rozhodně; již v roce 19991 se odhadovalo, že nové Alu inzerce byly detekovatelné přibližně u jednoho z 200 živě narozených dětí a byly zodpovědné za 0,1 % známých genetických poruch. Konkrétní zprávy z literatury zahrnují spontánní výskyt hemofilie;2-4 Apertova syndromu;5 neurofibromatózy typu 1;6 a atrofie optického nervu.7 Čtenáře, kteří hledají delší seznam, odkazujeme na přehled z roku 2012 a odkazy na něj, uvedené jako odkaz osm níže.
Klinické projevy související s rekombinačními událostmi ovlivněnými Alu je pravděpodobně obtížnější s jistotou identifikovat než ty z inzerce, ale případy byly zaznamenány (příklad viz odkaz devět) a jsou pravděpodobně častější, než víme.
Z hlediska léčby je každá Alu indukovaná mutace – inerční nebo rekombinační – jedinečná a léčba (pokud nějaká existuje) by se pravděpodobně musela týkat přímého biochemického zásahu do ovlivněné dráhy (ovlivněných drah), pokud je to možné, nebo možná nástrojů genetického inženýrství, jak se předpokládá u jiných vrozených genetických poruch. Proto zůstávají pro lékaře spíše kuriozitou než typem onemocnění s běžnou léčbou nebo prevencí – ale pravděpodobně s nezanedbatelnou četností u kořene nové genetické prezentace.
- Alu repetice a lidská onemocnění. Deininger P, Batzer M. Molecular Genetics and Metabolism 1999; 67(3):183-193.
- Alu insert jako příčina těžké formy hemofilie A. Sukarova E, Dimovski AJ, Tchacarova P, et al. Acta Haematol. 2001;106(3):126-9.
- Haemofilie B způsobená de novo inzercí pro člověka specifického člena podrodiny Alu v kódující oblasti genu pro faktor IX. Vidaud D, Vidaud M, Bahnak BR, et al. European Journal of Human Genetics 1993; 1(1):30-36.
- Přeskočení exonu způsobené intronickou inzercí mladého elementu Alu Yb9 vede k těžké hemofilii A. Ganguly A, Dunbar T, Chen P, et al. Human Genetics 2003; 113(4); 348-352.
- De novo vložení Alu prvku do FGFR2 identifikuje odlišný patologický základ Apertova syndromu. Oldridge M, Zackai EH, McDonald-McGinn DM, et al. American Journal of Human Genetics 1999; 64(2);446-461.
- De novo Alu inzerce má za následek neurofibromatózu typu 1. Wallace MR, Andersen LB, Saulino AM, et al. Nature 1991; 353(6347); 864-866.
- Vložení Alu prvku do intronové sekvence OPA1 spojené s autozomálně dominantní atrofií optiku. Gallus GN, Cardaioli E, Rufa A, et al. Molecular Vision 2010; 16; 178-183.
- Alu mobilní prvky: Od nevyžádané DNA ke genomovým drahokamům. Dridi S. Scientifica 2012. ID článku 545328, 11 stran.
- Mutace v LDL receptoru: Alu-Alu rekombinace odstraňuje exony kódující transmembránovou a cytoplazmatickou doménu. Lehrman MA, Schneider WJ, Südhof TC, et al. Science 1985; 227(4683); 140-146.
.