Místně řízená mutageneze (SDM) je technika používaná k mutaci jedné nebo více bází v plazmidu. Tento přístup může změnit složení aminokyselin, zničit vazebná místa transkripčních faktorů nebo vytvořit fúzní proteiny – to je jen několik příkladů.
Ačkoli se SDM nejčastěji používá ke zkoumání struktury a biologické aktivity nukleových kyselin a proteinů, je také užitečná pro zavedení nebo odstranění rozpoznávacích míst restrikčních enzymů, aby se usnadnilo klonování.
Dále může být SDM užitečným nástrojem optimalizace kodonů pro nahrazení vzácných kodonů v expresních vektorech, aby se zlepšila účinnost exprese heterologních proteinů. To je někdy nutné kvůli kodonovému zkreslení, což je jev, kdy organismy upřednostňují určité kodony před jinými v závislosti na dostupnosti tRNA v buňce. Více informací o používání kodonů a kodonovém zkreslení si můžete přečíst zde.
Při použití SDM ke změně kódující sekvence se vytvářejí specifické mutantní konstrukty, které postrádají kritická rezidua nebo proteinové domény zapojené do posttranslačních modifikací nebo regulace stability proteinů. Odstranění kritických zbytků nebo oblastí ve vašich plazmidech, jako jsou fosforylační místa nebo kritické domény, poskytuje jeden ze způsobů, jak prokázat důležitost určitých vlastností proteinu. Například změna fosforylačních míst, jako je serin na nereaktivní alanin nebo na fosfomimetika, jako je kyselina asparagová, přináší spolehlivý důkaz fosforylace specifické pro dané místo proteinu. Umožňuje studovat in vitro důsledky takových posttranslačních modifikací.
Tradiční přístupy k mutagenezi řízené na místě
Inverzní PCR
Pro delece nebo inzerce >50 bp je nejoblíbenějším přístupem inverzní PCR. Inverzní PCR používá primery zády k sobě k amplifikaci celého plazmidu, po níž následuje ligace lineárního produktu tvořícího kruhovou DNA. Tato technika je vhodná i pro větší inzerce nebo delece, např. odstranění regulační domény z proteinu.
U delecí lze vybranou oblast odstranit navržením primerů, které se annealují na obou stranách cílové deleční zóny. Amplifikace probíhá směrem ven z této oblasti, čímž se tato oblast vyloučí z produktu PCR. Po ligaci lineárního produktu bude váš nový konstrukt tuto deleční doménu postrádat. Tento postup je schematicky nastíněn na obrázku 1 níže.
Obrázek 1. Protokol pro inverzní PCR v SDM.
Inserce lze dosáhnout použitím překrývajících se primerů s doprovodnými sekvencemi, které obsahují příslušné báze navíc. Další informace o inverzní PCR najdete v těchto zdrojích:
- Ochman et al. (1998) Genetic Applications of an Inverse Polymerase Chain Reaction. Genetika. 120:621-623.
- Clifford N. Dominy a David W. Andrews. Site-Directed Mutagenesis by Inverse PCR (Mutageneze řízená místem pomocí inverzní PCR).
SDM pomocí modifikovaných primerů
Tato technika využívá modifikované primery k začlenění malých změn páru bází do plazmidu a je metodou volby pro mutace specifické pro dané místo. Pro začátek je třeba navrhnout několik primerů. Než však začnete:
- Vytiskněte si kopii tabulky kodonů aminokyselin
- Připravte si sekvenci plazmidu nebo proteinu.
- Ujistěte se, že víte, kde se nachází počáteční kodon a v jakém čtecím rámci se vaše sekvence čte.
Návrh primerů
Zaměřte se na primery SDM o délce přibližně 30 bp s vaším mutovaným místem co nejblíže středu. Ačkoli je přípustné vytvořit primery o něco delší nebo kratší podle potřeby, na obou stranách vašeho mutovaného místa by mělo být minimálně 12 bp.
Pokud potřebujete pomoc s návrhem primerů, http://molbiol-tools.ca/PCR.htm uvádí několik opravdu užitečných zdrojů, které vám usnadní cestu.
Vyberte správné reagencie
Obyčejná Taq polymeráza prostě nestačí, pokud jde o SDM – musíte použít korekturní enzym. Existuje celá řada komerčně dostupných polymerázových souprav, které jsou pro tento úkol vhodné a obsahují řadu funkcí včetně vysoké věrnosti (schopnosti korektury) a aktivace s horkým startem. Jednou z možností je In-Fusion HD Cloning Plus od společnosti Takara – řešení vše v 1, které obsahuje polymerázu s vysokou věrností, sadu pro čištění PCR, klonovací enzym a kompetentní buňky pro mutagenezi řízenou místem.
Mějte na paměti, že stejně jako většina laboratorních činidel má i mnoho polymeráz své výhody a nevýhody – obecně mají laboratoře historické důvody pro výběr jedné z nich a málokdy se od nich odchýlí. I když je rozumné držet se toho, co funguje, není na škodu přečíst si literaturu o dalších dostupných zdrojích, abyste se ujistili, že máte pro danou práci ta nejlepší činidla!“
PCR reakce
Podmínky použité při PCR se budou lišit v závislosti na výběru soupravy a polymerázy, stejně jako na navržených primerech a velikosti produktu. Níže uvedený příklad je však dobrým výchozím bodem.
| Krok | Teplota (°C) | Čas (s) | Cykly |
|---|---|---|---|
| Denatura | 94 | 15 | 18 |
| Žíhání | 60 | 30 | 18 |
| Extenze | 72 | 20/kb plazmidu | 18 |
Tabulka 1: Příklad programu tepelného cyklování SDM
Udržování nízkého počtu cyklů zabrání vzniku nežádoucích mutací. Osmnáct cyklů by mělo poskytnout přiměřené množství mutovaného produktu bez začlenění nežádoucích mutací. Všimněte si, že počet cyklů lze v případě potřeby během řešení problémů změnit.
Digest It!
Teď, když máte produkt PCR připravený, nezapomeňte na kritický krok – digesci! Zde trávíte rodičovskou templátovou DNA, abyste zajistili, že budete mít pouze mutovaný plazmid pro bakteriální transformaci. Standardní protokoly vyžadují 1hodinovou inkubaci při 37 °C s endonukleázou Dpn1, která stráví veškerou dammetylovanou a hemi-metylovanou rodičovskou DNA, čímž získáte požadovaný mutovaný plazmid.
Transformace a sekvenace
Transformujte svůj plazmid do kompetentních buněk stejně jako jakýkoli jiný expresní plazmid a izolujte jednotlivé kolonie pro izolaci plazmidu.
Teď byste měli mít malý objem požadovaného plazmidu. Než začnete experimentovat, pošlete vzorek na sekvenování, abyste potvrdili přítomnost požadované modifikace (modifikací). Stejně důležité je zajistit nepřítomnost jakýchkoli sekundárních nežádoucích mutací.
Pokud se sekvenování vrátí s pozitivním výsledkem – gratulujeme, jste profesionál v SDM! Pokud se však sekvenování vrátí s negativním výsledkem – nezoufejte! Vždycky to můžete zkusit znovu – naše odborné tipy pro řešení problémů s SDM by vás měly vrátit na správnou cestu!
V dnešní době klesajících nákladů na syntézu oligonukleotidů a pokroku v syntetické biologii získávají syntetické přístupy přednost před mutagenezí řízenou na místě. Kromě toho nástup technologie CRISPR/Cas9 také zjednodušil úpravu genů tak, že mutagenezi lze nyní provádět in vitro a in vivo v několika jednoduchých krocích. Nicméně SDM zůstává i nadále základním prvkem v sadě nástrojů molekulární biologie a v dohledné době nikam nezmizí.
Původně publikováno v roce 2016. Aktualizováno a znovu publikováno v roce 2018.
Pomohlo vám to? Pak se prosím podělte se svou sítí.
.