Transwellův migrační test je klasická technika, která vědcům umožňuje kvantifikovat pohyb buněk. Migrace se týká schopnosti buněk pohybovat se jednotlivě nebo ve shlucích. Pohyby buněk jsou umožněny přesnou restrukturalizací jejich cytoskeletu a k migraci obvykle dochází v reakci na podněty, které fungují jako signály.
Dnes probereme transwellský migrační test, který využívá jednoduché komůrkové uspořádání k hodnocení migrace v reakci na přitažlivé signály.
Na začátku uvedeme několik základních informací o transwellově komůrce.
Přístroj byl poprvé navržen Dr. Stephenem Boydenem v roce 1961, který jej použil ke studiu migrace leukocytů. Proto je tato metoda známá také jako Boydenova komůrková analýza.
V jednoduché Boydenově komůrce jsou vnější stěnou jamky, podobné těm na 96jamkové destičce. Uvnitř každé jamky je umístěn transwell, což je válcová vložka. Vložka má polykarbonátovou membránu s definovanou velikostí pórů. Po vložení do jamky rozdělí komůrku na dva oddíly. Do horního oddílu se nasadí buňky, jejichž migrační chování se má studovat, a do spodního zásobníku se umístí roztok chemoatraktantu. Podle definice je chemoatraktant molekula, která má schopnost podporovat pohyblivost buněk tím, že je „přitahuje“.
Díky těmto přitažlivým silám migrují buňky v horní komoře póry do spodního rezervoáru. Pokud mají buňky adherentní vlastnosti, jako některé buňky melanomu, po pohybu se „přilepí“ na spodní stranu membrány. V takovém případě lze membránu fixovat, obarvit a buňky spočítat pod mikroskopem. Na druhé straně neadherentní buňky, jako například spermie, budou migrovat do spodního rezervoáru. V tomto případě lze buňky v roztoku rezervoáru spočítat pomocí hemocytometru.
Přestože je nastavení této zkoušky jednoduché, je třeba před pokusem zvážit několik věcí. Zopakujme si některé z nich.
Začneme-li roztokem pro výsev, musíte se ujistit, že hustota je optimalizovaná pro pozorování migrace buněk. Příliš málo buněk může mít za následek nezjistitelnou migraci a větší hustota přeplní membránu, což ztíží sčítání migrace. Druhým hlediskem je velikost pórů vložky. Měla by být pečlivě zvolena v závislosti na typu buněk. Pokud je velikost pórů příliš malá, buňky nebudou schopny projít.
Případně, pokud je velikost pórů příliš velká, buňky prostě propadnou, což není migrace. A konečně je třeba dbát na koncentraci chemoatraktantu a inkubační dobu, která má být pro migraci povolena, protože jsou vzájemně závislé. Optimální koncentrace s vhodnou inkubační dobou, během níž je udržován koncentrační gradient mezi oddíly, vyvolá migraci buněk v důsledku chemoatrakce. Naopak delší inkubace může být doprovázena vyrovnáváním chemoatraktantu v celé komůrce, což vede ke ztrátě chemického gradientu, což může zkreslit analýzu získaných výsledků.
S ohledem na tyto úvahy probereme protokol používaný k měření migrace adherentních buněk.
Buňky, které mají být testovány, se připraví v médiu bez proteáz, protože proteázy mohou denaturovat důležité membránové receptory a v konečném důsledku ovlivnit migraci. Po přípravě buněk je třeba suspenzi naředit na optimální hustotu výsevu. Pro přípravu komůrky se do jamek na vícejamkové destičce umístí transwells. Buněčná suspenze by měla být pipetována do transwellové jamky, aniž by se dotýkala membrány nebo vnášela vzduchové bubliny.
Roztok hemoatraktantu se pipetuje do spodní nádržky a dbá se na to, aby se roztok dotýkal membrány vložky. Doba inkubace pro migraci bude záviset na experimentálních úvahách. Po inkubaci se membrány fixují ponořením vložky do 70% ethanolu. Poté, co se vložka nechá zaschnout, se přidá roztok pro barvení buněk.
Následující inkubace probíhá přibližně 30 minut při pokojové teplotě. Po inkubaci se vložky promyjí pomocí promývacího pufru. Nakonec lze membránu vyříznout a umístit na mikroskopické sklíčko. Buňky na spodní straně membrány představují počet buněk, které migrovaly v přítomnosti a nepřítomnosti chemoatraktantů.
Protože nyní máte představu o protokolu, pojďme se krátce podívat na to, jak výzkumníci tuto metodu používají při svém zkoumání.
Jednou z nejčastějších aplikací tohoto testu je hodnocení chemoatrakčních vlastností neznámých sloučenin. Zde se vědci zajímali o zkoumání plaveckých drah žabích spermií v přítomnosti alurinu, což je látka vylučovaná vajíčky obojživelníků. Za tímto účelem nejprve pipetovali aktivní žabí spermie do horní části transwellových vložek. Na dno přidali alurin. Poté, co nechali buňky migrovat, spočítali spermie v zásobním roztoku pod mikroskopem. Pomocí této techniky se jim podařilo vytvořit křivku koncentrace-odezva znázorňující vliv koncentrace alurinu na migraci spermií.
Když je buňka napadena patogeny, vysílá chemoatraktanty, aby rekrutovala imunitní buňky, které migrují, připojují se a následně řeší infekci. Aby tento jev otestovali, kultivovali tito vědci epitelové buňky na spodní straně destiček. Následně tyto buňky infikovali různými kmeny bakterií. Nakonec zavedli imunitní buňky do horní komory. Je známo, že infikované buňky produkují několik chemoatraktantů, které vyvolávají migraci imunitních buněk. Výsledky tohoto experimentu prokázaly různý stupeň migrace neutrofilů v reakci na různé typy bakteriální infekce.
Nakonec, invaze a metastazování nádorových buněk přes extracelulární matrix vždy zajímalo buněčné biology. Zde chtěli vědci zjistit, jak mohou specifické chemoatraktanty přispívat k takové migraci přes 3D matrici. Geneticky vytvořili dvě oddělené skupiny buněk: jednu exprimující zelený fluorescenční a druhou červený fluorescenční protein. Poté do horní části transwellů pipetovali imitaci extracelulární matrix.
Po ztuhnutí transwell obrátili a na spodní stranu membrány nasadili dva pooly buněk. Poté vyměnili vložku do multiwellové destičky a do horní komůrky napipetovali roztok chemoatraktantu. To způsobilo, že se buňky ve spodní části pohybovaly nahoru a skrz 3D matrici. Pomocí konfokálního zobrazování tito vědci rekonstruovali buněčnou migraci ve 3D a rozlišili migrační vzorce dvou skupin buněk.
Právě jste zhlédli video JoVE o transwellském migračním testu. Díky pochopení součástí a protokolu této metody nyní víte, proč ji buněční biologové tak hojně využívají. Navzdory jednoduchosti tohoto uspořádání ji řada konfigurací, kterým se tato metoda může přizpůsobit, činí nepostradatelnou pro studie pohyblivosti buněk. Jako vždy děkujeme za sledování!