Der Ames-Test ist ein biologischer Test zur Bewertung des mutagenen Potenzials chemischer Verbindungen. Er verwendet Bakterien, um zu testen, ob eine bestimmte Chemikalie Mutationen in der DNA des Testorganismus verursachen kann. Der Test wurde von Bruce N. Ames in den 1970er Jahren entwickelt, um festzustellen, ob eine Chemikalie ein Mutagen ist.
Ziel
Die mutagene Aktivität von Chemikalien zu bestimmen, indem beobachtet wird, ob sie Mutationen in Probebakterien verursachen.
Prinzip
- Der Ames-Test verwendet mehrere Bakterienstämme (Salmonella, E.coli), die eine bestimmte Mutation tragen.
- Punktmutationen werden im Histidin- (Salmonella typhimurium) oder im Tryptophan-Operon (Escherichia coli) vorgenommen, so dass die Bakterien nicht mehr in der Lage sind, die entsprechende Aminosäure zu produzieren.
- Diese Mutationen führen zu His- oder Trp-Organismen, die nicht wachsen können, wenn ihnen kein Histidin oder Tryptophan zugeführt wird.
- Wenn His-Salmonellen jedoch in einem Medium kultiviert werden, das bestimmte Chemikalien enthält, kommt es zu einer Mutation des Histidin kodierenden Gens, so dass sie die Fähigkeit zur Synthese von Histidin (His+) wiedererlangen. Das heißt, wenn ein mutagenes Ereignis eintritt, können Basensubstitutionen oder Frameshifts innerhalb des Gens eine Rückkehr zur Aminosäureprototrophie verursachen. Dies ist die umgekehrte Mutation.
- Diese umgekehrten Bakterien wachsen dann in Medien mit Histidin- bzw. Tryptophanmangel.
Das mutagene Potenzial einer Probe wird bewertet, indem Organismen, die Aminosäuren benötigen, verschiedenen Konzentrationen von Chemikalien ausgesetzt werden und auf das Reversionsereignis selektiert wird. Für diese Selektion werden Medien verwendet, denen die spezifische Aminosäure fehlt, so dass nur die Zellen überleben und wachsen können, die die Reversion zur Histidin/Tryptophan-Prototrophie durchlaufen haben. Wenn die Testprobe diese Reversion verursacht, ist sie mutagen.
Methode
I ) Isolieren Sie einen auxotrophen Stamm von Salmonella Typhimurium für Histidin. (d.h. His-ve)
II) Bereiten Sie eine Testsuspension von His-ve Salmonella Typhimurium in einem einfachen Puffer mit Testchemikalie (z.B. 2-Aminofluoren) vor. Fügen Sie auch eine kleine Menge Histidin hinzu.
Hinweis: Eine kleine Menge Histidin ist erforderlich, damit die Bakterien zu wachsen beginnen. Sobald das Histidin aufgebraucht ist, bilden nur noch die Bakterien Kolonien, die so mutiert sind, dass sie Histidin synthetisieren können.
III) Bereiten Sie auch eine Kontrollsuspension von His-ve Salmonella Typhimurium vor, jedoch ohne Testchemikalien.
IV) Bebrüten Sie die Suspensionen bei 37°C für 20 Minuten
V) Bereiten Sie die beiden Agarplatten vor und verteilen Sie die Suspension auf den Agarplatten.
VI) Bebrüten Sie die Platten bei 37°C für 48 Stunden.
VII) Nach 48 Stunden die Anzahl der Kolonien auf jeder Platte zählen.
Ergebnisinterpretation
- Die Mutagenität von Chemikalien ist proportional zur Anzahl der beobachteten Kolonien.
- Wenn es eine große Anzahl von Kolonien auf der Testplatte im Vergleich zur Kontrolle gibt, dann werden diese Chemikalien als Mutagene bezeichnet.
- Eine sehr geringe Anzahl von Kolonien kann auch auf der Kontrollplatte gesehen werden. Dies kann auf eine spontane Punktmutation auf dem Hisidin kodierenden Gen zurückzuführen sein.
Anwendungen
Der Ames-Test wird zwar zur Identifizierung von Rückmutationen in Stämmen verwendet, kann aber auch zum Nachweis der Mutagenität von Umweltproben wie Arzneimitteln, Farbstoffen, Reagenzien, Kosmetika, Abwässern, Pestiziden und anderen Substanzen, die leicht in einer flüssigen Suspension löslich sind, verwendet werden.
Vorteile
- Einfacher, schneller und robuster Bakterientest.
- Die Einfachheit und die niedrigen Kosten des Tests machen ihn unschätzbar wertvoll für das Screening von Substanzen in unserer Umwelt auf mögliche Karzinogenität.
- Ames Test kann geeignete Mutanten in großen Bakterienpopulationen mit hoher Empfindlichkeit erkennen.
Einschränkungen
- Einige Substanzen, die bei Labortieren Krebs verursachen (z.B. Dioxin), führen nicht zu einem positiven Ames-Test (und umgekehrt)
- Der Ames-Test besteht aus Salmonella typhimurium-Stämmen und ist daher kein perfektes Modell für den Menschen.