Antimikrobielle In-vitro-Empfindlichkeit von Aerococcus urinae gegenüber 14 Antibiotika, und Time-Kill-Kurven für Penicillin, Gentamicin und Vancomycin

Abstract

Aerococcus urinae ist ein Neuling in der klinischen und mikrobiologischen Praxis und verursacht Harnwegsinfektionen, Bakteriämie/Septikämie und/oder Endokarditis. In dieser Studie wird zum ersten Mal die Aktivität einer repräsentativen Gruppe von Antibiotika gegen eine große Anzahl von A. urinae-Isolaten bewertet. Die In-vitro-Empfindlichkeiten (MHK) von 56 Isolaten von A. urinae gegenüber 14 Antibiotika wurden durch Agarverdünnung bestimmt. Im Allgemeinen wiesen die A. urinae-Isolate eine geringe Variabilität zwischen den einzelnen Isolaten auf und hatten niedrige MHKs für Penicillin, Amoxicillin, Piperacillin, Cefepime, Vancomycin und Rifampicin. Eine hochgradige Aminoglykosidresistenz wurde bei keinem der Isolate festgestellt. Eine mäßige bis gute Aktivität wurde bei Chinolonen, Erythromycin und Tetracyclin festgestellt. Isolate von zwei Patienten mit Endokarditis wurden anhand von Time-Kill-Kurven für Penicillin, Gentamicin und Vancomycin untersucht. Penicillin und Vancomycin allein zeigten eine langsame oder gar keine bakterizide Wirkung gegen die beiden Stämme. Bei der Kombination von Penicillin oder Vancomycin mit Gentamicin wurde bei beiden Stämmen eine schnelle bakterizide Wirkung erzielt. Die Behandlungsmöglichkeiten für A. urinae scheinen Penicilline für weniger schwere Fälle zu umfassen. In schweren Fällen, d. h. bei Endokarditis, deuten die Time-kill-Untersuchungen auf eine günstige Wirkung der Kombination mit Gentamicin hin. Bei Penicillin-allergischen Patienten stellt Vancomycin in Kombination mit Gentamicin die naheliegendste Alternative dar.

Einführung

In den letzten zehn Jahren hat die klinische Bedeutung verschiedener katalase-negativer, gram-positiver Kokken viel Aufmerksamkeit erhalten.1 Unter ihnen ist Aerococcus urinae ein Neuling in der klinischen und mikrobiologischen Praxis, der erstmals 19892 beschrieben und 1992 benannt wurde.3A. urinae-Isolate wurden ursprünglich an ihrer Zellmorphologie (Staphylokokken-ähnlich in der Gram-Färbung) und ihren Wachstumsmerkmalen (ähnlich wie α-hämolytische Streptokokken auf Blutagar), einer negativen Katalase-Reaktion und einem sehr konstanten Antibiogramm erkannt, das eine Empfindlichkeit gegenüber Penicillin und eine Resistenz gegenüber Sulfonamiden und Aminoglykosiden zeigte.24 In zwei Berichten wurden A. urinae-Stämme aus 0,4-0,8 % der untersuchten Urinproben isoliert.2,5 Bei den meisten Patienten, von denen A. urinae isoliert wurde, handelte es sich um ältere Menschen mit prädisponierenden Erkrankungen und Anzeichen einer Harnwegsinfektion.2,4,5 Stämme, die Harnwegsinfektionen verursachen, wurden in Dänemark, Schweden, den Niederlanden, Frankreich, den USA, Kanada und südamerikanischen Ländern nachgewiesen.6A. urinae wurde auch aus dem Blut von Patienten isoliert, die an einer urogenen Bakteriämie/Septikämie mit oder ohne Endokarditis litten.711 Bei einer landesweiten Erhebung in Dänemark von 1987 bis 1995 wurden 26 Patienten mit aus Blut isoliertem A. urinae identifiziert,6 was 0,5 Patienten/Jahr/1 Million Einwohner und 0,8 % der infektiösen Endokarditis-Episoden entspricht.8 Bakteriämische/septikämische Episoden sprachen gut auf eine Behandlung mit β-Lactamen allein oder in Kombination mit einem Aminoglyco-Sid an, es sei denn, die Bakteriämie wurde durch eine Endokarditis kompliziert; in diesen Fällen starben fünf von sechs Patienten. Bei einem Patienten konnte bei der Autopsie A. urinae aus den Herzklappen gezüchtet werden, trotz scheinbar relevanter antibiotischer Behandlung. Daher muss die optimale Behandlung der Endokarditis mit A. urinae ermittelt werden.

Die Untersuchung von A. urinae-Isolaten mittels Tabletten-/Scheibendiffusionsverfahren hat die Empfindlichkeit gegenüber einem breiten Spektrum antimikrobieller Mittel ergeben, darunter sowohl β-Laktam- als auch Nicht-β-Laktam-Antibiotika.5,6,12 Da A. urinae-Isolate in erster Linie mit Harnwegsinfektionen in Verbindung gebracht wurden, ist es bemerkenswert, dass die Stämme gegen Sulfonamide und andere antimikrobielle Mittel, die zur Behandlung von Harnwegsinfektionen verwendet werden, einschließlich Co-Trimoxazol, Trimethoprim, Nalidixinsäure und Polymyxine, resistent waren.2,5,6,12 Kürzlich wurde die Empfindlichkeit von zwei A. urinae-Isolaten aus Endokarditis-Patienten anhand der MHKs von sieben Antibiotika untersucht, und es wurden Zeit-Kill-Kurven für Penicillin in Kombination mit Gentamicin oder Netilmicin erstellt.11 In der vorliegenden Studie wurde das Empfindlichkeitsmuster von 56 A. urinae-Isolaten unterschiedlicher geografischer Herkunft weiter charakterisiert. Die MHKs von 14 Antibiotika wurden bestimmt, und für zwei Isolate wurden Zeit-Kill-Kurven-Experimente mit Penicillin, Gentamicin und Vancomycin, allein oder in Kombination, durchgeführt, um mehr Informationen über optimale Behandlungsschemata für schwere Infektionen durch A. urinae zu erhalten.

Materialien und Methoden

Stämme

Fünfundfünfzig epidemiologisch nicht verwandte klinische Isolate von A. urinae wurden untersucht, darunter 42 dänische Isolate (17 Blutisolate und 25 Urinisolate) und 14 nicht-dänische Urinisolate: eines aus den Niederlanden (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von P. J. G. M. Rietra), vier aus Schweden (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von E. Falsen, Culture Collection, University of Göteborg) und sieben nordamerikanische Isolate (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Die folgenden Referenzstämme wurden verwendet: Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 und Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Antimikrobielle Mittel

Die folgenden antimikrobiellen Mittel wurden verwendet: Benzylpenicillin (Leo, Ballerup, Dänemark); Cefepime (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, USA); Amoxicillin, Ceftriaxon, Erythromycin, Amikacin, Gentamicin, Netilmicin, Rifampicin, Vancomycin (Sigma, St Louis, MO, USA); Oxytetracyclin (Rosco, Taastrup, Dänemark), Piperacillin (Lederle, Pearl River, NY, USA), Ciprofloxacin (Bayer, Leverkusen, Deutschland); und Sparfloxacin (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Frankreich).

MIC-Bestimmung

Aufgrund des anspruchsvollen Wachstums von A. urinae mussten die Testbedingungen von den Standardempfehlungen abgewandelt werden, um MIC-Bestimmungen durchführen zu können (d.h. 5%iger Blutzusatz zum Agar und Bebrütung in 5%iger CO2-Atmosphäre für 48 h).13-15 Die MICs wurden durch die Agarverdünnungsmethode bestimmt. Zweifache serielle Verdünnungen der antimikrobiellen Wirkstoffe wurden in Mueller-Hinton-Agar (Difco Laboratories GmbH, Augsburg, Deutschland) hergestellt, der mit 5 % lysiertem Pferdeblut versetzt war. Es wurden Antibiotika von 0,008 bis 512 mg/L getestet, mit Ausnahme von Amoxicillin (0,032-256 mg/L), Rifampicin (0,008-32 mg/L) und Oxytetracyclin (0,008-2 mg/L). Die Inokula von 107 cfu/ml (104 cfu/Fleck) wurden aus Übernacht-Agar-Kulturen hergestellt und in 0,9 % NaCl suspendiert und mit einem 21-Punkt-Mehrfachinokulator (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, UK) aufgetragen. Die Ergebnisse wurden nach 2-tägiger Bebrütung bei 37°C und 5% CO2 abgelesen. Die MHK wurde als die niedrigste Konzentration abgelesen, die das Wachstum von maximal drei Kolonien zeigte.

Untersuchungen der Time-Kill-Kurve

Zwei der getesteten Blutisolate (B1 und B8), beide von Patienten mit Endokarditis, wurden untersucht. Die Stämme wurden gegen Penicillin (MIC 0,125 bzw. 0,6 mg/L), Gentamicin (MIC 256 bzw. 64 mg/L) und Vancomycin (MIC 0.5 bzw. 1 mg/L) in den folgenden klinisch erreichbaren Konzentrationen: Penicillin 2 × und 10 × MHK (P2 bzw. P10); Vancomycin 4 × und 10 × MHK (V4 bzw. V10); Gentamicin 10 mg/L (G10); und die Kombinationen Penicillin + Gentamicin und Vancomycin + Gentamicin in den folgenden Konzentrationen: P2G10, P10G10, V4G10 bzw. V10G10. Bei t = -1 h wurden frische, über Nacht gewachsene Kolonien mit ca. 105 cfu/ml in Röhrchen mit vorgewärmter Todd-Hewitt-Bouillon suspendiert. Die Röhrchen wurden bei 37°C in ein Wasserbad gestellt. Bei t = 0 h wurden den Röhrchen Antibiotika, die unmittelbar vor dem Test zubereitet wurden, in doppelter Menge zugesetzt. Drei Röhrchen ohne Antibiotika wurden als Wachstumskontrolle verwendet. Von jedem Röhrchen wurden nach 0, 3, 6 und 24 Stunden Proben in doppelter Ausführung entnommen. Die Proben wurden seriell verdünnt und ausgeplattet. Die Anzahl der überlebenden Kolonien wurde nach einer Inkubation über Nacht bei 37 °C in Raumluft in Plastikbeuteln zusammen mit feuchtem Seidenpapier gezählt. Bei Verwendung von 20 μL Proben lag die minimale zählbare Bakterienzahl bei 50 cfu/mL. Der Carry-over-Effekt wurde bei den Penicillin-Gentamicin-Experimenten durch Zugabe von 100 μL 100 000 U/mL Penicillinase zu jeder Platte eliminiert. Bei den Vancomycin-Gentamicin-Experimenten wurde der Carry-over-Effekt durch Verdünnung eliminiert. Eine Pilotuntersuchung zeigte einen Verschleppungseffekt in der 100er-Probe, aber nicht in der 10-1er-Probe. Daher wurden die KBE unter Verwendung von 200 μl der 10-1er-Proben gezählt, was immer noch eine Nachweisgrenze von 50 KBE/ml ergibt. Alle Versuche wurden mindestens zweimal an verschiedenen Tagen durchgeführt. Bakterizide Aktivität wurde definiert als eine Reduktion des Inokulums um mindestens 99,9 % innerhalb von 24 Stunden. Synergie (S), additive Wirkung (A) und Antagonismus wurden definiert als: >2 log mehr Abtötung (S), >1 und <2 log mehr Abtötung (A) bzw. >2 log weniger Abtötung für die Kombination im Vergleich zum besten der einzelnen Antibiotika.

Ergebnisse

MIC-Bestimmung

Die für die 56 Isolate ermittelten MICs sind in der Tabelle aufgeführt. Unter Verwendung der von der NCCLS14,15 oder der Schwedischen Referenzgruppe für Antibiotika (SRGA) empfohlenen Bruchpunkte für Streptokokken16,17 waren die Isolate gegenüber den Penicillinen empfindlich, während für die getesteten Cephalosporine eine geringere Empfindlichkeit festgestellt wurde. Die MHKs für die Aminoglykoside wiesen für fast alle Isolate eine verminderte Empfindlichkeit auf. Eine hochgradige Aminoglykosid-Resistenz (d. h. Gentamicin > 1000 mg/L) wurde jedoch bei keinem der Isolate festgestellt. Alle Isolate waren empfindlich gegenüber Vancomycin. Rifampicin war das aktivste getestete Medikament mit einer MHK50 von 0,031 mg/L (Bereich <0,004-0,064 mg/L), außer bei einem Isolat mit einer MHK > 32 mg/L (wiederholte Tests). Die Aktivitäten der Chinolone Ciprofloxacin und Sparfloxacin erwiesen sich als gleich gut.

Tötungskurvenuntersuchungen

Die durchschnittlichen Zeit-Tötungskurven für jeden Versuch sind in der Abbildung dargestellt. Vancomycin allein (sowohl 4 × als auch 10 × MHK) zeigte eine bakterizide Aktivität gegen den Stamm B1. Bei Penicillin wurde nur bei 10 × MHK eine bakterizide Aktivität gegen B8 festgestellt. Bei beiden Antibiotika war die bakterizide Wirkung langsam, d. h. sie trat erst nach 24 Stunden auf. Gentamicin war nicht bakterizid – in den meisten Experimenten wurde Wachstum beobachtet. Penicillin in Kombination mit Gentamicin wirkte synergistisch und war für den Stamm B8 sowohl in P2G10 als auch in P10G10 schnell bakterizid. Für den Stamm B1 wurde jedoch nur eine additive und langsame bakterizide Wirkung festgestellt. Bei der Kombination von Vancomycin mit Gentamicin wurde für beide Stämme eine schnelle bakterizide Wirkung festgestellt. Ein synergistischer Effekt war nach 3 und 6 Stunden für den Stamm B8 nachweisbar. Nach 24 Stunden war die abtötende Wirkung von Vancomycin jedoch so ausgeprägt, dass ein Synergieeffekt nicht mehr nachweisbar war. Für B1 wurde nur eine additive Wirkung festgestellt. In keinem der Experimente wurden antagonistische Wirkungen festgestellt.

Diskussion

In dieser Studie wird zum ersten Mal eine Bewertung der MHKs einer repräsentativen Gruppe von Antibiotika gegen eine große Anzahl von A. urinae-Isolaten vorgestellt, die von Patienten mit Harnwegsinfektionen, Bakteriämie/Septikämie und/oder Endokarditis stammen. Um die Verwendung von Antibiogrammen für taxonomische Zwecke zu bewerten, wurden zuvor die MHKs von 15 Antibiotika für 10 A. urinae-Stämme untersucht,12 aber es wurden keine detaillierten Daten vorgelegt.

A. urinae sind anspruchsvolle Organismen, die eine Ergänzung des Mediums mit Blut und manchmal eine Bebrütung in einer CO2-angereicherten Atmosphäre und/oder eine längere Inkubationszeit erfordern, um ein ausreichendes Wachstum für die Prüfung der Antibiotikaempfindlichkeit zu erzielen. Daher konnten die Stämme nicht unter den von BSAC oder NCCLS beschriebenen Standardbedingungen getestet werden.13-15 Die Notwendigkeit, die Kulturbedingungen zu ändern, ist jedoch ein häufiges Problem bei anspruchsvollen grampositiven Bakterien.18,19 A. urinae-Isolate wiesen ein ähnliches Empfindlichkeitsmuster gegenüber antimikrobiellen Mitteln auf wie α-hämolysierende Streptokokken mit nur geringen Empfindlichkeitsschwankungen zwischen den Isolaten. Die MHKs der β-Lactame für die Isolate lagen typischerweise innerhalb von vier zweifachen Verdünnungsschritten, mit Ausnahme der Cephalosporine Ceftriaxon und Cefepime, die eine größere Variation der MHK aufwiesen (Tabelle). Aufgrund des möglichen Einflusses der CO2-Inkubation (Absenkung des pH-Wertes) ist bei der Beurteilung der Empfindlichkeit gegenüber Tetracyclin (überschätzte Empfindlichkeit) und Erythromycin (unterschätzte Empfindlichkeit) Vorsicht geboten. Unter den untersuchten A.-urinae-Isolaten wurde keine hochgradige Resistenz gegen die getesteten Aminoglykoside festgestellt, was die Möglichkeit eines Synergieeffekts in Kombination mit einem β-Lactam oder Vancomycin offen lässt (vide infra). Nach den MHKs zu urteilen, gibt es mehrere Behandlungsalternativen für schwere Infektionen, da die Isolate für Penicilline, Vancomycin und Rifampicin (mit Ausnahme eines Isolats) empfindlich waren. Die ausgewählten Chinolone, Ciprofloxacin und Sparfloxacin, zeigten ebenfalls eine gute Aktivität. Obwohl es sich um einen anspruchsvollen Organismus handelt, stimmten die mit Scheibendiffusionsverfahren2,5,20 erzielten Ergebnisse mit den in dieser Studie vorgestellten MHKs überein, was darauf hindeutet, dass mit diesen routinemäßigen Empfindlichkeitsmethoden ein zuverlässiges Ergebnis erzielt werden kann.

Leitlinien für die Behandlung schwerer Infektionen wie Septikämie mit oder ohne Endokarditis sollten optimalerweise auf klinischen Erfahrungen in sorgfältig konzipierten Studien beruhen, was jedoch bei seltenen Bakterien schwierig ist. Daher können In-vitro-Studien mit Tötungskurvenverfahren in diesen Fällen wichtige Informationen für den Kliniker liefern.

Für die Versuche wurden in vivo erreichbare Antibiotika-Konzentrationen gewählt. Für Gentamicin wurde eine Dosis von 10 mg/L gewählt, was der Konzentration entspricht, die bei einer einmal täglichen Verabreichung von 240 mg (entspricht 3-4 mg/kg) erreicht wird.21 Obwohl in mehreren Veröffentlichungen eine zweimal tägliche Verabreichung bei Endokarditis empfohlen wird, wird in Dänemark üblicherweise einmal tägliches Gentamicin verwendet, da die Nephrotoxizität verringert wird und der Synergieeffekt mit β-Lactam-Antibiotika mit steigender Aminoglykosidkonzentration zunimmt.22 Die in unserer In-vitro-Studie über die Abtötungskurven von Penicillin und Vancomycin gewonnenen Daten zeigten, dass weder Penicillin noch Vancomycin gegen eines der beiden getesteten Isolate von Patienten mit infektiöser Endokarditis bakterizid war. In Kombination mit Gentamicin wurde sowohl für Penicillin als auch für Vancomycin eine bakterizide Wirkung gegen beide Isolate erzielt. Glücklicherweise werden diese Therapien weltweit für die Behandlung infektiöser Endokarditis unbekannter Ätiologie empfohlen.23 Die Abtötungsraten der beiden Stämme waren unterschiedlich, was darauf hindeutet, dass es zwischen den Stämmen Variationen geben kann. Trotz der In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber den verabreichten Antibiotika stellten wir fest, dass die Prognose für ältere Patienten, die an einer durch A. urinae verursachten infektiösen Endokarditis leiden, schlecht ist.8 Die vorliegenden Ergebnisse für Penicillin, Gentamicin und Netilmicin (MHK) stimmen mit denen des jüngsten Schweizer Berichts von Zbinden et al.11 für zwei A. urinae-Isolate von Endokarditis-Patienten überein.

Die Behandlungsmöglichkeiten für A. urinae scheinen Penicilline für weniger schwere Fälle zu umfassen. In schweren Fällen, d. h. bei Endokarditis, deuten die Time-kill-Untersuchungen darauf hin, dass eine Kombination von Penicillin oder Vancomycin mit Gentamicin von Vorteil ist. Bei Penicillin-Allergikern stellt Vancomycin die naheliegendste Alternative dar.

Tabelle.

MICs von 14 antimikrobiellen Wirkstoffen gegen A. urinae (n = 56)

Die obere Grenze der Empfindlichkeit für Streptokokken nach NCCLS15 oder nach SRGA16,17 ist durch graue Schattierung gekennzeichnet.

aAnzahl der Stämme.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

Tabelle.

MICs von 14 antimikrobiellen Wirkstoffen vonr A. urinae (n = 56)

Die obere Grenze der Empfindlichkeit für Streptokokken nach dem NCCLS15 oder nach SRGA16,17 durch graue Schattierung gekennzeichnet.

aAnzahl der Stämme.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L