Im Jahr 1979 wurde Marshall als Assistenzarzt für Medizin am Royal Perth Hospital eingestellt. Während seiner Ausbildung zum Facharzt für Innere Medizin am Royal Perth Hospital lernte er 1981 Robin Warren kennen, einen Pathologen, der sich für Gastritis interessierte. Gemeinsam untersuchten die beiden das Vorhandensein von Spiralbakterien im Zusammenhang mit Gastritis. Im Jahr 1982 führten sie die erste Kultur von H. pylori durch und entwickelten ihre Hypothese über die bakterielle Ursache von Magengeschwüren und Magenkrebs. Es wurde behauptet, dass die H. pylori-Theorie von etablierten Wissenschaftlern und Ärzten belächelt wurde, die nicht glaubten, dass Bakterien in der sauren Umgebung des Magens leben könnten. Marshall wurde 1998 mit den Worten zitiert: „Alle waren gegen mich, aber ich wusste, dass ich Recht hatte“. Andererseits wurde auch argumentiert, dass medizinische Forscher ein angemessenes Maß an wissenschaftlicher Skepsis an den Tag legten, bis die H. pylori-Hypothese durch Beweise untermauert werden konnte.
Im Jahr 1982 erhielten Marshall und Warren Mittel für ein Jahr Forschung. Die ersten 30 von 100 Proben zeigten keine Unterstützung für ihre Hypothese. Es stellte sich jedoch heraus, dass die Labortechniker die Kulturen nach 2 Tagen weggeworfen hatten. Dies war die übliche Praxis für Rachenabstriche, bei denen andere Organismen im Mund die Kulturen nach 2 Tagen als unbrauchbar erscheinen ließen. Aufgrund anderer Arbeiten im Krankenhaus hatten die Labortechniker keine Zeit, den 31. Test am zweiten Tag sofort zu verwerfen, und so blieb er von Donnerstag bis zum Montag liegen. In dieser Probe entdeckten sie das Vorhandensein von H. pylori. Es stellte sich heraus, dass H. pylori langsamer als 2 Tage wachsen und dass die Magenkulturen nicht durch andere Organismen kontaminiert sind.
Im Jahr 1983 reichten sie ihre bisherigen Ergebnisse bei der Gastroenterological Society of Australia ein, aber die Gutachter lehnten ihre Arbeit ab, da sie zu den untersten 10 % der 1983 eingegangenen Arbeiten gehörte.
Nach fehlgeschlagenen Versuchen, Ferkel zu infizieren, trank Marshall 1984 nach einer Basisendoskopie eine Brühe, die kultiviertes H. pylori enthielt, in der Erwartung, dass er vielleicht Jahre später ein Geschwür entwickeln würde. Er war überrascht, als er nur drei Tage später vage Übelkeit und Mundgeruch entwickelte (aufgrund der Achlorhydrie gab es keine Säure, um die Bakterien im Magen abzutöten, und ihre Abfallprodukte machten sich als Mundgeruch bemerkbar), was nur von seiner Mutter bemerkt wurde. An den Tagen 5-8 entwickelte er achlorhydrisches Erbrechen (ohne Säure). Am achten Tag wurde eine erneute Endoskopie durchgeführt, die eine massive Entzündung (Gastritis) und eine Biopsie ergab, aus der H. pylori kultiviert wurde, was zeigte, dass es seinen Magen besiedelt hatte. Am vierzehnten Tag nach der Einnahme wurde eine dritte Endoskopie durchgeführt, und Marshall begann mit der Einnahme von Antibiotika. Marshall entwickelte keine Antikörper gegen H. pylori, was darauf hindeutet, dass die angeborene Immunität eine akute H.-pylori-Infektion manchmal auslöschen kann. Marshalls Erkrankung und Genesung, die auf einer Kultur von Organismen aus einem Patienten beruhte, erfüllte die Koch’schen Postulate für H. pylori und Gastritis, nicht aber für Magengeschwüre. Dieses Experiment wurde 1985 im Medical Journal of Australia veröffentlicht und gehört zu den am häufigsten zitierten Artikeln der Zeitschrift.
Nach seiner Arbeit am Fremantle Hospital forschte Marshall am Royal Perth Hospital (1985-86) und an der University of Virginia, USA (seit 1986), bevor er nach Australien zurückkehrte, während er weiterhin an der Fakultät der University of Virginia tätig war. Von 1998 bis 2003 hatte er ein Burnet-Stipendium an der University of Western Australia (UWA) inne. Marshall setzt seine Forschung im Zusammenhang mit H. pylori fort und leitet das H. pylori Research Laboratory an der UWA.
Im Jahr 2007 nahm Marshall eine Teilzeitstelle an der Pennsylvania State University an.
Im August 2020 nahm Barry Marshall zusammen mit Simon J. Thorpe eine Position im wissenschaftlichen Beirat von Brainchip INC, einem Computerchip-Unternehmen, an.