Der Transwell-Migrationsassay ist eine klassische Technik, mit der Wissenschaftler die Zellbewegung quantifizieren können. Migration bezieht sich auf die Fähigkeit einer Zelle, sich einzeln oder in Gruppen zu bewegen. Zellbewegungen werden durch eine präzise Umstrukturierung des Zytoskeletts ermöglicht, und die Migration erfolgt in der Regel als Reaktion auf Stimuli, die als Anreize wirken.
Heute werden wir den Transwell-Migrationsassay besprechen, bei dem ein einfacher Kammeraufbau verwendet wird, um die Migration als Reaktion auf anziehende Anreize zu bewerten.
Zunächst werden wir einige Hintergrundinformationen zur Transwell-Kammer geben.
Das Gerät wurde erstmals 1961 von Dr. Stephen Boyden entwickelt, der es zur Untersuchung der Leukozytenmigration einsetzte. Daher ist diese Methode auch als Boyden-Kammer-Assay bekannt.
In einer einfachen Boyden-Kammer besteht die Außenwand aus Vertiefungen, wie bei einer 96-Well-Platte. In jede Vertiefung wird ein Transwell, ein zylindrischer Einsatz, eingesetzt. Der Einsatz besteht aus einer Polycarbonatmembran mit einer bestimmten Porengröße. Wenn er in die Vertiefung eingesetzt wird, teilt er die Kammer in zwei Kompartimente. In das obere Kompartiment werden die Zellen, deren Wanderungsverhalten untersucht werden soll, ausgesät, und in das untere Reservoir wird die Lösung des Chemoattraktivums eingebracht. Laut Definition ist ein Chemoattraktionsmittel ein Molekül, das die Fähigkeit hat, die Zellmotilität zu fördern, indem es „Zellen anzieht“
Durch diese Anziehungskräfte wandern die Zellen im oberen Kompartiment durch die Poren in das untere Reservoir. Wenn die Zellen adhärente Eigenschaften haben, wie einige Melanomzellen, werden sie nach der Bewegung an der Unterseite der Membran „kleben“. In diesem Fall kann die Membran fixiert und gefärbt werden, und die Zellen können unter dem Mikroskop gezählt werden. Andererseits wandern nicht haftende Zellen, wie Spermien, in das untere Reservoir. In diesem Fall können die Zellen in der Reservoir-Lösung mit Hilfe eines Hämozytometers gezählt werden.
Auch wenn der Aufbau dieses Tests einfach ist, gibt es einige Dinge, die Sie vor dem Experiment beachten müssen. Lassen Sie uns einige von ihnen überprüfen.
Bei der Aussaatlösung ist darauf zu achten, dass die Dichte für die Beobachtung der Zellmigration optimiert ist. Zu wenige Zellen können zu einer nicht nachweisbaren Migration führen, und größere Dichten führen zu einer Überbevölkerung der Membran, was die Auszählung der Migration erschwert. Die zweite Überlegung betrifft die Porengröße des Einsatzes. Sie sollte je nach Zelltyp sorgfältig ausgewählt werden. Ist die Porengröße zu klein, können die Zellen nicht hindurchgehen.
Ist die Porengröße dagegen zu groß, fallen die Zellen einfach durch, was keine Migration darstellt. Schließlich muss auf die Konzentration des Chemoattraktivums und die Inkubationszeit geachtet werden, die für die Migration erforderlich sind, da diese voneinander abhängig sind. Eine optimale Konzentration mit einer angemessenen Inkubationszeit, während der ein Konzentrationsgradient zwischen den Kompartimenten aufrechterhalten wird, induziert die Zellmigration aufgrund der Chemo-Attraktion. Umgekehrt kann es bei längerer Inkubation zu einer Angleichung des Chemoattraktivums in der gesamten Kammer kommen, was zum Verlust des chemischen Gradienten führt, was die Analyse der erzielten Ergebnisse beeinträchtigen kann.
Anhand dieser Überlegungen soll nun ein Protokoll zur Messung der Migration adhärenter Zellen erörtert werden.
Die zu untersuchenden Zellen werden in einem proteasefreien Medium vorbereitet, da Proteasen wichtige Membranrezeptoren denaturieren und letztlich die Migration beeinträchtigen können. Nachdem die Zellen vorbereitet sind, sollte die Suspension auf eine optimale Aussaatdichte verdünnt werden. Zur Vorbereitung der Kammer werden die Transwells in die Vertiefungen einer Multiwell-Platte eingesetzt. Die Zellsuspension sollte in die Transwells pipettiert werden, ohne die Membran zu berühren oder Luftblasen einzuführen.
Die Chämoattraktivitätslösung wird in das untere Reservoir pipettiert, wobei darauf zu achten ist, dass die Lösung die Membran des Einsatzes berührt. Die Inkubationszeit für die Migration hängt von den experimentellen Überlegungen ab. Nach der Inkubation werden die Membranen durch Eintauchen des Einsatzes in 70%iges Ethanol fixiert. Nachdem der Einsatz getrocknet ist, wird die Zellfärbelösung zugegeben.
Dann werden die Zellen etwa 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation werden die Einsätze mit Hilfe von Waschpuffer gewaschen. Schließlich kann die Membran herausgeschnitten und auf einen Objektträger gelegt werden. Die Zellen auf der Unterseite der Membran stellen die Anzahl der Zellen dar, die in Anwesenheit und Abwesenheit von Chemoattraktanten gewandert sind.
Da Sie nun ein Gefühl für das Protokoll haben, lassen Sie uns einen kurzen Blick darauf werfen, wie Forscher diese Methode in ihren Untersuchungen verwenden.
Eine der häufigsten Anwendungen dieses Tests ist die Bewertung der chemoattraktiven Eigenschaften unbekannter Verbindungen. In diesem Fall waren die Wissenschaftler daran interessiert, die Schwimmwege von Froschspermien in Gegenwart von Allurin zu untersuchen, einer Substanz, die von Amphibieneiern abgesondert wird. Zu diesem Zweck pipettierten sie zunächst aktive Froschspermien auf die Oberseite der Transwell-Einsätze. Auf den Boden gaben sie Allurin. Nachdem sie die Zellen wandern ließen, zählten sie die Spermien in der Reservoir-Lösung unter dem Mikroskop. Mit dieser Technik konnten sie eine Konzentrations-Wirkungs-Kurve erstellen, die die Auswirkung der Allurin-Konzentration auf die Spermienwanderung zeigt.
Wenn eine Zelle von Krankheitserregern angegriffen wird, sendet sie Chemoattraktoren aus, um Immunzellen zu rekrutieren, die einwandern, sich anlagern und die Infektion anschließend beseitigen. Um dieses Phänomen zu testen, kultivierten die Wissenschaftler Epithelzellen auf der Unterseite der Einsätze. Anschließend infizierten sie diese Zellen mit verschiedenen Bakterienstämmen. Schließlich brachten sie Immunzellen in die obere Kammer ein. Es ist bekannt, dass die infizierten Zellen verschiedene Chemoattraktoren produzieren, die die Migration von Immunzellen auslösen. Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass die Migration von Neutrophilen als Reaktion auf verschiedene Arten von bakteriellen Infektionen unterschiedlich stark ist.
Die Invasion und Metastasierung von Krebszellen durch die extrazelluläre Matrix hat Zellbiologen schon immer fasziniert. Hier wollten die Wissenschaftler herausfinden, wie spezifische Chemoattraktoren zu einer solchen Migration durch eine 3D-Matrix beitragen können. Sie stellten zwei getrennte Zellpools her: einen, der grün fluoreszierendes, und einen, der rot fluoreszierendes Protein exprimiert. Anschließend pipettierten sie ein extrazelluläres Matrix-Imitat auf die Oberseite der Transwells.
Sobald es sich verfestigt hatte, drehten sie die Transwells um und setzten zwei Zellpools auf der Unterseite der Membran ein. Anschließend setzten sie den Einsatz wieder in die Multiwell-Platte ein und pipettierten die Chemoattraktivitätslösung in die obere Kammer. Dies bewirkte, dass sich die Zellen am Boden nach oben und durch die 3D-Matrix bewegten. Mit Hilfe der konfokalen Bildgebung konnten die Forscher die Zellwanderung in 3D rekonstruieren und die Wanderungsmuster zweier Zellgruppen unterscheiden.
Sie haben soeben das Video von JoVE über den Transwell-Migrationstest gesehen. Mit dem Verständnis der Komponenten und des Protokolls dieser Methode wissen Sie nun, warum sie von Zellbiologen so häufig verwendet wird. Trotz der Einfachheit dieses Versuchsaufbaus macht die Vielfalt der Konfigurationen, die mit dieser Methode möglich sind, sie für Studien zur Zellmotilität unverzichtbar. Wie immer, vielen Dank fürs Zuschauen!