Probanden
In diese Studie wurden 88 behandlungsnaive LC-Patienten ohne Fernmetastasen einbezogen. Bei allen Patienten wurde durch die pathologische Untersuchung von Proben ein Plattenepithelkarzinom des Kehlkopfes diagnostiziert und sie wurden zwischen Januar 2008 und Dezember 2017 in der Abteilung für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde, Kopf- und Halschirurgie der Universität der Ryukyus behandelt. Die endgültige Prognose der Patienten wurde im Juli 2018 beurteilt. Die Klassifizierung des Tumor-, Knoten- und Metastasenstadiums (TNM) erfolgte nach dem AJCC Staging Manual (7. Auflage). Zur Bestimmung des klinischen Stadiums und zur Erkennung begleitender multipler Primärkarzinome unterzogen sich die Patienten einer körperlichen und endoskopischen Untersuchung des oberen Gastrointestinaltrakts, einer Ultraschalluntersuchung des Halses, einer Computertomographie (CT) und einer 18F-Fluordesoxyglucose-Positronenemissionstomographie-CT-Bildgebung.
Diese Studie wurde vom Institutional Review Board der University of the Ryukyus genehmigt und in Übereinstimmung mit der Deklaration von Helsinki von 1975 in der 2008 überarbeiteten Fassung durchgeführt. Von allen LC-Patienten wurde vor der Aufnahme in die Studie eine informierte Zustimmung eingeholt.
Behandlung
Die Hauptbehandlung für die primäre Läsion mit kurativer Absicht war konventionelle Strahlentherapie (RT) allein oder Laser-Resektion bei T1, gleichzeitige Chemoradiotherapie (CCRT) bei T2, CCRT oder Operation bei T3 und Operation bei T4, unabhängig vom Vorhandensein von HPV. Nodale Läsionen wurden mit CCRT oder Neck Dissection in Kombination mit der Resektion der Primärläsion behandelt. Bei allen Patienten, die eine RT (Gesamtdosis 70 Gy) erhielten, wurde eine CT-gestützte dreidimensionale Bestrahlungsplanung in der Behandlungsposition mit Maskenimmobilisierung durchgeführt. Das Protokoll für die CCRT wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt. Wenn der Primärtumor in T3 unabhängig vom Ansprechen der Halslymphknoten bei einer Bestrahlung von 39,6 Gy kein partielles Ansprechen zeigte, unterzogen sich die Patienten einer kurativen Operation der primären Läsion in Kombination mit einer Neck Dissection.
Nachweis des HPV-Status und p16-Immunhistochemie
Alle Gewebeproben von Primärläsionen ohne Bestrahlung oder Chemotherapie wurden mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) für den HPV-DNA-Nachweis anhand frischer gefrorener Proben, die bei der Biopsie oder chirurgischen Resektion gewonnen wurden, und mit p16-Immunhistochemie anhand von FFPE-Proben analysiert. Fälle mit negativem HPV-Nachweis in der PCR und p16-Überexpression (≥75 % positive Zellen und mindestens mäßige Färbeintensität) wurden mittels In-situ-Hybridisierung (ISH) mit HPV-DNA-Sonden (DNA-ISH) weiter auf ihren HPV-Status untersucht. Eine quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) für die Viruslast und den physikalischen Status, wie unten beschrieben, wurde in Fällen mit HPV-16 durchgeführt.
PCR für HPV-DNA-Nachweis
Kurz gesagt, wurde DNA aus den Tumorproben mit einem Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD) isoliert. Das Vorhandensein und die Integrität der DNA wurde in allen Proben durch PCR β-Globin-Gen-Amplifikation mit den Primern PC04 und GH20 überprüft. Die allgemeinen Konsensus-Primersätze GP5+/GP6+ und MY09/MY11 wurden zur Analyse des Vorhandenseins von HPV-DNA mittels PCR verwendet (Tabelle 1), wie zuvor beschrieben. Darüber hinaus wurden DNA-Proben, die bei der GP5+/GP6+- oder MY09/MY11-PCR negativ waren, mit Hilfe eines Nested-PCR-Ansatzes mit dem GP5+/GP6+-Primerpaar erneut vervielfältigt. PCR-Produkte der erwarteten Größe (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) wurden gereinigt und direkt mit einem ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) sequenziert. Die Sequenzen wurden mit Hilfe des BLAST-Programms mit denen bekannter HPV-Typen in der GenBank-Datenbank verglichen.
p16-Immunhistochemie
Die Immunhistochemie für p16 wurde mit einem CINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Deutschland) gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt. Die Immunfärbung wurde durch Inkubation in 3,3′-Diaminobenzidin sichtbar gemacht und die gefärbten Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Die in der vorliegenden Studie verwendeten Bewertungskriterien für die p16-Immunreaktivität waren wie folgt: 0, keine Färbung; 1, 1 – < 25% der Tumorzellen positiv für p16; 2, 25 – < 50% positiv; 3, 50 – < 75% positiv; 4, ≥75% positiv und schwache Färbungsintensität; und 5, ≥75% positiv und mindestens moderate Färbungsintensität. Der Begriff „p16-Überexpression“ (p16-positiv) wurde in der vorliegenden Studie mit einem Score von 5 definiert.
ISH mit HPV-DNA-Sonden
Biotinyltyramid-basierte ISH wurde mit der GenPoint™ HPV biotinylierten DNA-Sonde und dem GenPoint Tyramid-Signalverstärkungssystem für biotinylierte Sonden gemäß dem Herstellerprotokoll (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) durchgeführt. Die biotinylierte GenPoint-HPV-DNA-Sonde reagiert mit den HPV-Typen 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68 in 4-μm-Dickschnitten von FFPE-Proben. Die Detektion der hybridisierten Sonde erfolgte mit dem GenPoint-Detektionssystem nach dem Protokoll des Herstellers, das primäre Streptavidin-Meerrettichperoxidase (HRP), Biotinyltyramid, sekundäre Streptavidin-HRP und 3,3′-Diaminobenzidin l (Dako; Agilent Technologies) enthält. Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt.
Schätzung der Viruslast und des physikalischen Status von HPV-16 durch qPCR
Um die Viruslast und den physikalischen Status von HPV-16 zu bewerten, wurde qPCR wie zuvor beschrieben durchgeführt. Es wurden Primer und TaqMan-Sonden verwendet, die auf die offenen Leserahmen von HPV-16 E2 und E6 abzielen (Tabelle 1). Die Primer und Sonden erkennen die E2-Scharnierregion, die bei der HPV-16-Integration deletiert wird. Zwei Standardkurven für die E2- und E6-Gene wurden durch Amplifikation von 10-fachen seriellen Verdünnungen (101, 102, 103, 104, 105 und 106 virale Kopien) des pB-actin early Plasmids erstellt, das ein Geschenk von Karl Munger war und die vollständige HPV-16 early Genregion trägt (Addgene Plasmid # 13711; Addgene, Cambridge, MA). Die virale DNA-Last wurde durch Berechnung der E6-Kopienzahl ermittelt. Eine externe Standardkurve wurde unter Verwendung bekannter serieller Verdünnungen (0,3, 3, 30 und 300 ng) humaner genomischer Plazenta-DNA (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) für die zelluläre DNA-Quantifizierung erstellt, und β-Globin wurde wie zuvor beschrieben amplifiziert. Die DNA-Menge wurde berechnet, indem die Cq-Werte gegen den Logarithmus der Standardkurve aufgetragen wurden. Der physikalische Status von HPV-16 wurde auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Methode bewertet. Ein E2/E6-Verhältnis ≥ 1 zeigt das Vorherrschen der episomalen Form an, während ein Verhältnis von E2-Kopienzahl/Gesamt-E6 < 1 das Vorhandensein sowohl integrierter als auch episomaler Formen (Mischform) anzeigt.
Nachweis der E6-mRNA-Expression durch qPCR und RNA-ISH bei HPV-16-positiven Patienten mit p16-Überexpression
Die E6-mRNA-Expression wurde in Proben von Patienten nachgewiesen, die als HPV-16-positiv mit p16-Überexpression identifiziert wurden. Die Gesamt-RNA wurde aus gefrorenem Gewebe mit RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japan) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Gesamt-RNA (500 ng) wurde zur Synthese von cDNA-Erststrängen unter Verwendung eines PrimeScript™ RT Reagent Kit mit gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Zur Messung der HPV-16 E6 mRNA-Expression wurde eine qPCR mit dem CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) und dem TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA) durchgeführt. Es wurden Primer und TaqMan-Sonden (Tabelle 1) verwendet, die auf das HPV-16 E6-Gen und das β-Actin-Gen abzielen. Die β-Actin-Sonde war am 5′-Ende mit FAM und am 3′-Ende mit TAMRA markiert (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japan). Die Amplifikationsbedingungen waren: 2 min bei 50 °C, 10 min bei 95 °C und ein 2-Schritt-Zyklus von 95 °C für 15 s und 60 °C für 60 s für insgesamt 40 Zyklen. Zwei Standardkurven wurden für die E6- und β-Actin-Gene durch Amplifikation serieller 10-facher Verdünnungen (101, 102, 103, 104, 105 und 106 Kopien) des frühen pB-Actin-Plasmids und des pCAG-mGFP-Actin-Plasmids erstellt, das ein Geschenk von Ryohei Yasuda war und die vollständige kodierende Region von β-Actin trägt (Addgene-Plasmid # 21948; Addgene). Die Expression des E6-Gens in jeder Probe wurde durch die Menge der internen Kontrolle β-Actin normalisiert.
RNA ISH für HPV-16/- 18 E6/E7 mRNA wurde mit einem RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Dazu wurden 4 μm dicke Serienschnitte von FFPE-Proben in Xylol deparaffiniert und mit einer abgestuften Alkoholreihe rehydriert. Die endogene Peroxidase wurde mit dem RNAscope® Wasserstoffperoxid-Reagenz bei Raumtemperatur für 10 Minuten blockiert. Das Retrieval der HPV-RNA wurde mit dem RNAscope® Target Retrieval Reagent bei 100 °C für 15 Minuten durchgeführt. Die Objektträger wurden mit RNAscope® Protease Plus bei 40 °C für 30 Minuten verdaut. Die HPV-16/- 18 E6/E7 RNA-Sonde (RNAscope® Probe-HPV16/18) wurde auf die Schnitte gegeben und ein Deckglas aufgelegt. Die Objektträger wurden zur Hybridisierung bei 40 °C für 2 h in eine befeuchtete Kammer überführt. Anschließend wurden die Deckgläser entfernt und die Objektträger bei 40 °C mit RNAscope® Wash Buffer Reagent gewaschen. Die Signalverstärkung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die Detektion der hybridisierten Sonde erfolgte mit 3,3′-Diaminobenzidin (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). Die Objektträger wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Positive Kontroll-Objektträger (HeLa-Zellen, die HPV-18 E6/E7 mRNA exprimieren) wurden in die RNA-ISH einbezogen. Eine positive Färbung wurde als braune punktförmige Punkte im Zellkern und/oder Zytoplasma identifiziert.
Statistische Analyse
Der Chi-Quadrat-Test nach Pearson wurde verwendet, um die Merkmale der LC-Patienten je nach HPV-DNA und p16-Überexpressionsstatus zu vergleichen. Das kumulative Überleben (CS) wurde mit der Kaplan-Meier-Methode berechnet und mit dem Log-Rank-Test zwischen zwei Gruppen verglichen. Alle Analysen wurden mit SPSS Statistical Package (SPSS, Version 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY) durchgeführt. P < 0,05 wurde als signifikant angesehen.