GyrB und GyrA Expression und Reinigung
Die Sequenz, die für die volle Länge von E. coli GyrA (2-875) kodiert, wurde in ein modifiziertes pET28b eingefügt, das einen N-terminalen 10-His-Tag und einen C-terminalen Twin-strep-Tag enthält. Die Überexpression erfolgte in E. coli BL21 (DE3) pRARE2 in LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin und 35 µg/mL Chloramphenicol. Die Zellen wurden nach Erreichen einer OD600 von 0,85 mit 0,35 mM IPTG induziert, und das Protein wurde 4 Stunden lang bei 37 °C exprimiert. Die Zellen wurden geerntet und in Lysepuffer (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 10 % v/v Glycerin, pH 8,0) resuspendiert und mit drei Zyklen Hochdruckaufschluss mit EmulsiFlex-C3 bei 1500 bar lysiert. Das GyrA-Protein wurde durch Nickel-Affinitätschromatographie auf einer manuell gepackten XK 26/20-Säule (Pharmacia) mit Chelating Sepharose 6 Fast Flow-Harz (GE Healthcare), das an Ni2+-Ionen gebunden ist, gereinigt. Die Elution erfolgte mit Lysispuffer, der 250 mM Imidazol pH 8,0 enthielt, und die eluierten Proteine wurden direkt an eine 10 ml Streptavidin-Sepharose (GE Healthcare) gebunden. Die Proteine wurden ausgiebig mit Strep-Puffer (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10 % v/v Glycerin, pH 8,0) gewaschen und mit Strep-Puffer mit 3 mM Desthiobiotin (Sigma-Aldrich) eluiert. Sowohl der 10-His-Tag als auch der Twin-strep-Tag wurden anschließend durch PreScission-Protease (P3C) und Tobacco-Etch-Virus (TEV)-Spaltung (Massenverhältnis 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) über Nacht bei 4 °C gespalten. GyrA wurde dann durch einen Anionenaustausch-Chromatographieschritt mit einer HiTrap Q HP-Säule (GE Healthcare) weiter gereinigt. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 20 Säulenvolumina mit Puffer B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v Glycerin, pH 8,0) eluiert. Die GyrA-haltigen Fraktionen wurden gepoolt und auf eine Superdex S200 16/60-Größenausschlusschromatographiesäule (GE Healthcare) mit 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10 % v/v Glycerin, pH 8,0 geladen. 37 mg GyrA wurden aus 3 L Kulturen gewonnen. Die kodierende Sequenz von GyrB (2-804) wurde in das gleiche modifizierte pET28b eingefügt. Die Überexpression wurde in E. coli BL21 (DE3) pRARE2 in LB-Medium mit 50 µg/mL Kanamycin und 35 µg/mL Chloramphenicol durchgeführt. Die Zellen wurden nach Erreichen einer OD600 von 0,85 mit 0,35 mM IPTG induziert, und das Protein wurde 18 Stunden lang bei 18 °C exprimiert. Das Verfahren zur Reinigung von GyrB entspricht dem oben für GyrA beschriebenen. 10 mg GyrB wurden aus 3 L Kulturen gewonnen.
Vollständige DNA-Gyrase-Rekonstitution
E. coli GyrA und GyrB wurden im äquimolaren Verhältnis gemischt, um eine vollständige DNA-Gyrase-Rekonstitution zu ermöglichen. Der Komplex wurde auf einer Superdex S200 16/60 Größenausschlusschromatographiesäule (GE Healthcare) unter Verwendung von Kryo-EM-Puffer (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) weiter gereinigt (Abb. 1 und ergänzende Abb. 1). 1).
Nukleinsäurepräparation
Ein doppelt gekerbter 180 bp DNA-Duplex wurde unter Verwendung von 2 phosphorylierten asymmetrischen synthetischen Oligonukleotiden12 rekonstituiert, die von Sigma-Aldrich bezogen wurden (ergänzende Tabelle 1). Die Nukleinsäuren wurden in DNAse-freiem Wasser in einer Konzentration von 1 mM aufgelöst. Zum Aufbau der doppelsträngigen DNA wurde jedes Oligo in einem Molverhältnis von 1:1 gemischt und bei 95 °C für 2 min inkubiert, dann wurde die Temperatur alle 1 min um 1 °C gesenkt, bis sie 20 °C erreichte. Der vernetzte doppelt eingekerbte DNA-Duplex wurde dann mit einer BioSpin 6-Säule (BioRad) in Hepes 20 mM pH 8,0 gepuffert.
Komplexbildung für Kryo-EM
Die gereinigte DNA-Gyrase wurde mit der 180 bp dsDNA in einem molaren Verhältnis von 1:1 mit einer endgültigen Protein- und DNA-Konzentration von 32 µM gemischt. Die Mischung wurde 10 min bei 37 °C inkubiert. Gepotidacin (GSK2140944, erworben bei MedChemExpress), resuspendiert mit 10 mM in 100 % DMSO, wurde zugegeben, um eine Endkonzentration von 170 µM (1,7 % DMSO) zu erreichen. Die Mischung wurde 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. AMP-PNP (Sigma) wurde dem Komplex in einer Endkonzentration von 340 µM zugesetzt. Der vollständig rekonstituierte Komplex wurde weitere 30 Minuten bei 30 °C inkubiert. Schließlich wurde dem Komplex 8 mM CHAPSO (Sigma-Aldrich) zugesetzt. Die Probe wurde 2 h bei 16.000 × g zentrifugiert, um potenzielle Aggregate zu entfernen.
Cryo-EM-Gittervorbereitung
Quantifoil R-1.2/1.3 Kupfergitter mit 300 Mesh wurden vor dem Auftragen von 4 µl des Komplexes für 20 s glühend aufgeladen. Nach 30 s Inkubation wurden die Gitter in flüssigem Ethan mit einem Vitrobot Mark IV (FEI) bei 95 % Kammerfeuchtigkeit und 10 °C eingefroren.
Elektronenmikroskopie
Die Kryo-EM-Bildgebung wurde mit einem Titan Krios-Mikroskop bei 300 kV (FEI) durchgeführt, das mit einer K2 Summit-Direktelektronenkamera (Gatan), einem GIF Quantum-Energiefilter (Gatan) im Null-Energieverlust-Modus mit einer Spaltbreite von 20 e-V, einer Volta-Phasenplatte (FEI) und einem CS-Korrektor (FEI) ausgestattet war. Die Bilder wurden im EFTEM-Nanosondenmodus mit der Serie EM53 im superauflösenden Zählmodus bei einer nominalen Vergrößerung von 130.000x mit einer superauflösenden Pixelgröße von 0,44 Å und einem konstanten Defokussierungsziel von -500 nm aufgenommen (ergänzende Abb. 2c). Das VPP wurde alle 100 Minuten in eine neue Position gebracht (ergänzende Abb. 2b). Vier Datensätze wurden mit einer Dosisleistung von 6 bis 8 e-/Pixel/s (0,88 Å Pixelgröße an der Probe) auf dem Detektor aufgenommen. Die Bilder wurden mit einer Gesamtdosis von 50 e-/Å2, einer Belichtungszeit von 7 bis 10 s und Subframes von 0,2 bis 0,25 s (35 bis 50 Gesamtframes) aufgenommen. Nach der Datenerfassung der 4 Datensätze wurden insgesamt 11.833 Filme aufgenommen.
Datenverarbeitung
Die Datenverarbeitung jedes Datensatzes erfolgte separat nach demselben Verfahren bis zur 3D-Verfeinerung, als die Partikel zusammengeführt wurden. Die dosisfraktionierten Subframes der Superauflösung wurden mit IMOD54 gewinnkorrigiert und zweimal durch Fourier-Cropping gebinnt, driftkorrigiert und mit MotionCor255 dosisgewichtet, so dass Summenbilder mit einer Pixelgröße von 0,88 Å entstanden. Die Kontrastübertragungsfunktion der korrigierten Mikrofotografien wurde mit GCTF v1.0656 geschätzt. Die Thonringe wurden manuell auf Astigmatismus geprüft, und Bilder mit einer gemessenen Auflösung von weniger als 4 Å wurden aussortiert, so dass 8.701 Bilder übrig blieben. Die Partikel wurden automatisch mit dem referenzfreien Gaußschen Blob-Picking-Protokoll in RELION229,30 ausgewählt. Aus den 4 Datensätzen wurden insgesamt 1.572.962 Partikel ausgewählt. Die vierfach gebinnten Partikel aus jedem Datensatz wurden separat zwei Runden der 2D-Klassifizierung in RELION2 unterzogen, um Junk-Partikel und Verunreinigungen zu entfernen, so dass insgesamt 479 667 Partikel für die weitere Verarbeitung zur Verfügung standen. Die Partikel aus den vier Datensätzen wurden zu einem einzigen Datensatz zusammengeführt, gefolgt von einer erneuten Extraktion mit Zentrierung im 3 × 3 gebinnten Format. Anschließend wurde eine letzte Runde der 2D-Klassifizierung durchgeführt, die einen endgültigen Partikelstapel von 338.616 Partikeln ergab. Der anschließende Partikelstapel wurde einer Runde der 3D-Ab-initio-Klassifizierung in cryoSPARC31 unterzogen. Nachdem die Modelle mit schlechter Qualität verworfen wurden, ergab das verbleibende ab-initio-Modell einen endgültigen Datensatz von 191.456 Partikeln mit einer Klassenwahrscheinlichkeit von 0,9 (ergänzende Abb. 2a). Das ab-initio-Modell wurde auf 30 Å tiefpassgefiltert und als Referenz für die homogene Verfeinerung in cryoSPARC verwendet, was zu einer 5,4 Å-Karte führte. Die verfeinerten Partikelkoordinaten wurden dann zur lokalen CTF-Schätzung mit GCTF v1.06 verwendet, gefolgt von einer erneuten Extraktion von 2 × 2 gebinnten Partikeln mit Zentrierung. Dieser neue Partikelstapel wurde einer 3D-Autoverfeinerung in RELION2 unterzogen, wobei das Ab-initio-Modell mit einem Tiefpassfilter von 30 Å gefiltert wurde, was zu einer Karte mit einer globalen Auflösung von 5,0 Å führte (ergänzende Abb. 3). Die lokale Auflösung zeigte einen Bereich von 4,0 Å im DNA-Bindungs-/Spaltungskern bis zu 9,0 Å in der ATPase-Domäne und dem GyrA-β-Zahnrad, das die DNA umhüllt, was auf eine hohe Flexibilität dieser beiden Module hindeutet. Um eine endgültige Rekonstruktion des gesamten Komplexes mit klar definierten Dichten für jede Domäne zu erhalten, führten wir eine 3D-Klassifizierung ohne Alignment durch, die mehrere verschiedene Klassen ergab. Partikel aus drei Klassen wurden zusammengeführt (94.633 Partikel). Der anschließende 1 × 1 gebinnte Partikelstapel wurde in RELION2 ohne Maske bis zu den letzten Verfeinerungsiterationen verfeinert, bei denen eine weiche Maske zur Verbesserung der Auflösung angewendet wurde. Die Nachbearbeitung der Karte ergab eine Rekonstruktion des Gesamtkomplexes mit einer Auflösung von 6,6 Å (ergänzende Abb. 3).
Eine Kombination aus verschiedenen lokalen Ansätzen wurde verwendet, um verschiedene Konformationen zu identifizieren und die lokale Auflösung jeder Domäne zu verbessern. Da die ATPase-Domäne zu klein für eine fokussierte 3D-Verfeinerung war, führten wir zunächst eine fokussierte 3D-Klassifizierung der ATPase-Domäne mit einer weichen Maske und ohne Ausrichtung in RELION2 durch. Eine Klasse von 58.329 Partikeln mit einer gut definierten Dichte der ATPase-Domäne wurde ausgewählt, gefolgt von einer erneuten Extraktion von 1 × 1 gebinnten Partikeln, die Partikel mit einer Pixelgröße von 0,88 Å/Pixel ergab. Um ein genaues Alignment der Partikel zu ermöglichen, wurde diese Klasse in RELION2 mit einer weichen Maske um die ATPase-Domäne und die DNA-bindende/spaltende Domäne weiter verfeinert, was eine Karte mit 5,9 Å globaler Auflösung (ATPase-Core) ergab (ergänzende Abb. 3).
Zweitens führten wir eine fokussierte 3D-Klassifizierung des GyrA β-Pinwheel mit einer weichen Maske und ohne Alignment in RELION2 durch. Eine Klasse von 45.040 Partikeln mit einer gut definierten Dichte des GyrA β-Zahnrads wurde ausgewählt, gefolgt von einer erneuten Extraktion von 1 × 1 gebinnten Partikeln, die Partikel mit einer Pixelgröße von 0,88 Å/Pixel ergab. Diese Klasse wurde in RELION2 mit einer weichen Maske um das β-Pinwheel und die DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne weiter verfeinert, was zu einer Karte mit einer Auflösung von 6,3 Å führte (CTD-Core) (ergänzende Abb. 3).
Schließlich wurde eine fokussierte 3D-Auto-Verfeinerung in RELION2 mit einer weichen Maske um die DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne durchgeführt. Die Nachbearbeitung der Karte ergab eine Rekonstruktion der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne mit einer Auflösung von 4,3 Å. Anschließend wurde eine gezielte 3D-Klassifizierung der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne durchgeführt. Zwei der Klassen zeigten bessere Winkelgenauigkeiten und eindeutige geschlossene (60.548 Partikel) und vor-öffnende Konformationen (53.655 Partikel) der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne. Diese beiden Klassen wurden in RELION2 durch fokussierte 3D-Verfeinerung mit einer C2-Symmetrie unter Verwendung von 1 × 1 gebinnten Partikeln weiter verfeinert und ergaben nach dem Post-Processing Rekonstruktionen mit einer globalen Auflösung von 4,0 bzw. 4,6 Å (ergänzende Abb. 3). Die geschlossene DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne wurde durch fokussierte 3D-Verfeinerung unter Verwendung einer weichen Maske weiter verfeinert, die die ungeordnete TOPRIM-Insertion ausschließt und eine 4,0 Å-Karte von hoher Qualität ergibt (ergänzende Abb. 3).
Alle angegebenen Auflösungen basieren auf dem Goldstandard FSC-0.143 Kriterium57 und die FSC-Kurven wurden für die Faltungseffekte einer weichen Maske mittels hochauflösender Rauschsubstitution58 sowohl in RELION2 als auch in cryoSPARC korrigiert (ergänzende Abb. 4a). Alle Rekonstruktionen wurden durch Anwendung eines negativen B-Faktors geschärft, der mithilfe automatisierter Verfahren geschätzt wurde59. Die lokale Auflösung der Karten wurde mit Blocres60 berechnet (siehe ergänzende Abb. 4c). Die Kryo-EM-Karten des Gesamtkomplexes, des ATPase-Kerns, des CTD-Kerns und der DNA-bindenden/spaltenden Domäne im geschlossenen (mit und ohne TOPRIM-Insertion) und im vorgeöffneten Zustand wurden in der EM Data Bank unter den Zugriffsnummern EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909 bzw. EMD-4912 hinterlegt.
Modellbildung und Verfeinerung
Die EM-Rekonstruktion der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne ohne die TOPRIM-Insertion, die bei 4,0 Å gelöst wurde, war von bester Qualität. Fast alle Seitenketten waren zu erkennen und die Gepotidacin-Dichte war deutlich sichtbar. Diese Karte wurde zur Verfeinerung einer Kristallstruktur der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne der E. coli DNA-Gyrase17 verwendet. Ein dimeres atomares Modell der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne wurde mit PDB 3NUH in PyMol (Schrödinger L.L.C.) erstellt. Dem anschließenden Atommodell wurden die zur TOPRIM-Insertion gehörenden Aminosäuren, alle Ionen und Wassermoleküle entzogen, wobei alle Belegungen auf 1 und die B-Faktoren auf 50 gesetzt wurden. Zunächst wurde das Atommodell in der gefilterten und geschärften Karte mit Chimera61 an den Starrkörper angepasst. Eine erste Runde der Realraumverfeinerung in PHENIX62 wurde mit lokaler Realraumanpassung und globaler gradientengesteuerter Minimierungsverfeinerung durchgeführt. Anschließend wurden 20 Nukleinsäuren aus der Struktur der DNA-Gyrase von S. aureus41 (PDB 5IWM) kopiert und in unser atomares Modell eingepasst. Die DNA-Sequenz wurde entsprechend der in unserer Struktur verwendeten DNA modifiziert. Die fehlenden Proteinreste und Nukleinsäuren wurden manuell in COOT63 eingebaut. Das Atommodell und das Beschränkungswörterbuch von Gepotidacin (GSK-2140944) wurden mit dem Grade-Server (http://grade.globalphasing.org) erstellt. Gepotidacin wurde dann manuell in die leere Elektronendichte in COOT eingepasst und anschließend dupliziert. Beide Duplikate wurden auf 0,5 Belegungen eingestellt. Es wurden mehrere Verfeinerungsrunden im realen Raum in PHENIX unter Verwendung von Einschränkungen für Sekundärstruktur, Rotamere, Ramachandran und nicht-kristallografische Symmetrie durchgeführt, immer gefolgt von einer manuellen Inspektion in COOT, bis ein konvergierendes Modell erhalten wurde. Schließlich wurden die B-Faktoren durch eine abschließende Verfeinerung im realen Raum in PHENIX mit den gleichen Einstellungen wie zuvor verfeinert. Nachdem die Verfeinerung konvergiert hatte, wurden die Atomkoordinaten der TOPRIM-Einfügung zum Atommodell hinzugefügt. Es wurde in den EM-Rekonstruktionen, die die Dichte der Einfügung in geschlossenen und vorgeöffneten Zuständen enthalten, nach demselben Verfahren weiter verfeinert. Es wurde eine Kreuzvalidierung mit halben Karten durchgeführt, um 1,5 als bestes Verfeinerungsgewicht in PHENIX zu definieren, das die Reduzierung von Atomkollisionen und die Vermeidung von Modellübereinstimmungen ermöglicht (ergänzende Abb. 4e). Alle Verfeinerungsschritte wurden unter Verwendung der Auflösungsgrenze der Rekonstruktionen gemäß dem Goldstandard FSC-0.143-Kriterium57 durchgeführt. Die Verfeinerungsparameter, Modellstatistiken und Validierungsergebnisse sind in der ergänzenden Tabelle 2 zusammengefasst. Die Atommodelle der E. coli-DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne in geschlossener (mit und ohne Insertion) und vor der Öffnung befindlicher Konformation wurden in der Protein Data Bank unter den Zugangsnummern 6RKU, 6RKS bzw. 6RKV hinterlegt.
Für den Gesamtkomplex verwendeten wir eine Kombination verschiedener EM-Rekonstruktionen, um das Atommodell des DNA-Gyrase-Gesamtkomplexes zu erstellen. Die ATPase-Kernstruktur, die bei 5,9 Å gelöst wurde, wurde verwendet, um die Kristallstruktur der ATPase-Domäne im Komplex mit ADPNP32 (PDB 1EI1) und der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne, die in geschlossener Konformation verfeinert wurde, in Chimera starrkörperlich anzupassen. Die Qualität der Elektronendichte erlaubte es, in COOT die fehlenden Reste des Linkers zwischen der ATPase-Domäne und der DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne zu konstruieren. Die bei 6,3 Å gelöste CTD-Core-Struktur wurde verwendet, um die β-Pinwheel-Kristallstruktur10 in Chimera genau zu fitten. Die 10 fehlenden Aminosäuren (564-574) nach der GyrA-Box wurden mit dem Modellierungsserver Phyre264 hinzugefügt. Die Qualität der elektronischen Dichte ermöglichte es, in COOT die fehlenden Nukleinsäuren um das β-Zahnrad sowie die 10 Aminosäuren, die die letzten GyrA-Reste mit dem β-Zahnrad verbinden, zu bauen. Basierend auf einer Sekundärstrukturvorhersage wurde ein Teil des Linkers als Alpha-Helix gebaut (Abb. 3). Das anschließende Atommodell, das die ATPase-Domäne, die DNA-Bindungs-/Spaltungsdomäne und ein β-Pinwheel enthält, wurde mit Hilfe von Chimera in die Gesamtstruktur des Komplexes eingepasst, die bei 6,6 Å gelöst wurde. Anschließend wurde eine Kopie des ersten β-Pinwheels in die Dichte des zweiten β-Pinwheels in COOT eingepasst. Die fehlenden Nukleinsäuren um das zweite β-Zahnrad sowie die fehlenden 10 Reste des Linkers wurden manuell in COOT aufgebaut. Das resultierende Atommodell wurde um alle Ionen und Wassermoleküle bereinigt, wobei alle Belegungen auf 1 und die B-Faktoren auf 50 gesetzt wurden. Schließlich wurde das Atommodell in PHENIX mit Hilfe der Starrkörper- und der globalen gradientengesteuerten Minimierungsverfeinerung im realen Raum gegen die Gesamtstruktur des Komplexes verfeinert. Die Auflösungsgrenze für die Verfeinerung wurde gemäß dem Goldstandard FSC-0.143-Kriterium57 festgelegt. Es wurden auch Half-Map-Kreuzvalidierungen durchgeführt (siehe ergänzende Abb. 4e). Die Verfeinerungsparameter, Modellstatistiken und Validierungsergebnisse sind in der ergänzenden Tabelle 2 zusammengefasst. Das atomare Modell der Gesamtstruktur wurde in der Protein Data Bank unter der Zugangsnummer 6RKW hinterlegt. Alle Abbildungen wurden mit Chimera61, ChimeraX65 und PyMol (Schrodinger L.L.C.) erstellt.
Aufreinigung von E. coli GyrB R286K, R286Q und E264A
Das modifizierte pET28b, das für die Überexpression von Wildtyp E. coli GyrB Überexpression verwendet wurde, wurde durch ortsgerichtete Mutagenese mit dem QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) mutiert, um drei Plasmide zu erzeugen, die die Mutationen R286K, R286Q oder E264A tragen (ergänzende Tabelle 4). Die Verfahren zur Überexpression und Reinigung der drei Mutanten sind identisch mit denen des Wildtyps von GyrB, die oben im Abschnitt Methoden beschrieben sind.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q Reinigung
Das modifizierte pET28b, das für den Wildtyp von T. thermophilus GyrB Überexpression12 verwendete modifizierte pET28b wurde durch ortsgerichtete Mutagenese mit dem QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) mutiert, um zwei Plasmide zu erzeugen, die K284R- oder K284Q-Mutationen tragen (ergänzende Tabelle 4). Überexpression und Reinigungsverfahren für die beiden Mutanten sind identisch mit dem oben im Abschnitt Methoden beschriebenen E. coli Wildtyp GyrB.
DNA-Supercoiling-Assay
Eine steigende Konzentration von DNA-Gyrase (GyrA2B2) wurde bei 37 °C mit 6 nM entspanntem pUC19-Plasmid in einer Reaktionsmischung inkubiert, die 20 mM Tris-Acetat pH 7,9, 100 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA enthielt. Nach 30 Minuten wurden die Reaktionen durch Zugabe von 1 % SDS gestoppt. Mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese wurde die Umwandlung des entspannten pUC19 in die supergespulte Form verfolgt. Die Proben wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel mit 1X Tris-Borat-EDTA-Puffer (TBE) bei 6 V/cm für 180 Minuten bei Raumtemperatur gelagert. Die Agarosegele wurden 15 Minuten lang mit 0,5 mg/ml Ethidiumbromid in 1X TBE gefärbt, gefolgt von 5 Minuten Entfärbung in Wasser. DNA-Topoisomere wurden mit einem Typhoon (GE Healthcare) nachgewiesen.
ATPase-Aktivitätstest
ATP-Hydrolyse wird gemessen, indem die Oxidation von NADH durch Pyruvatkinase (PK) und Laktatdehydrogenase (LDH) verfolgt wird. Die Absorption wurde bei 340 nm über 600 s bei 37 °C mit einem Shimadzu 1700 Spektrophotometer gemessen. Die Reaktionen wurden in dreifacher Ausführung mit 50-100 nM GyrA2B2 und 16 nM linearer DNA (pCR-blunt) in 500 µl eines Puffers aufgenommen, der 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM Kaliumacetat, 8 mM Magnesiumacetat, 7 mM BME, 100 µg/mg BSA, 4U/5U PK/LDH-Gemisch, 2 mM PEP und 0.2 mM NADH.
Mehrfaches Alignment und evolutionäre Erhaltung von Resten
GyrB ATPase/Transducer-Protein-Sequenzen aus 30 Arten (Uniprot-Codes: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa; Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) wurden mit dem Clustal Omega Server (EMBL-EBI) ausgerichtet. Das anschließende Alignment wurde verwendet, um die evolutionäre Erhaltung der Aminosäuren an der ATPase/Transducer-Struktur (PDB ID 1EI1) mit Hilfe des ConSurf-Servers (http://consurf.tau.ac.il) darzustellen. Der phylogenetische Baum wurde durch die Methode der Nachbarschaftsverbindung unter Verwendung des multiplen Alignments in Clustal Omega erstellt.
Zusammenfassung der Berichterstattung
Weitere Informationen zum Forschungsdesign sind in der Nature Research Reporting Summary verfügbar, die mit diesem Artikel verlinkt ist.