APL bietet seit 1998 Dienstleistungen zur Analyse nativer Gele an. Heutzutage ignorieren leider viele Labors dieses wertvolle Werkzeug, weil sie denken, dass native Gele einfach zu schwer zu handhaben sind, oder weil sie fälschlicherweise glauben, dass sie nur mit sauren Proteinen verwendet werden können. Bei Alliance Protein Laboratories führen wir routinemäßig native Gele sowohl für basische als auch für saure Proteine durch. Wir führen gerne Proben für Sie durch und/oder arbeiten mit Ihnen zusammen, um ein Protokoll für die Verwendung in Ihrem Labor zu entwickeln.
Was ist ein natives Gel?
„Native“ oder „nicht-denaturierende“ Gelelektrophorese wird in Abwesenheit von SDS durchgeführt. Während bei der SDS-PAGE die elektrophoretische Mobilität der Proteine in erster Linie von ihrer Molekülmasse abhängt, hängt die Mobilität bei der nativen PAGE sowohl von der Ladung des Proteins als auch von seiner hydrodynamischen Größe ab.
Die elektrische Ladung, die die Elektrophorese antreibt, wird von der intrinsischen Ladung des Proteins beim pH-Wert des Laufpuffers bestimmt. Diese Ladung hängt natürlich von der Aminosäurezusammensetzung des Proteins sowie von posttranslationalen Modifikationen wie dem Zusatz von Sialinsäuren ab.
Da das Protein seine gefaltete Konformation beibehält, variieren seine hydrodynamische Größe und Mobilität auf dem Gel auch mit der Art dieser Konformation (höhere Mobilität für kompaktere Konformationen, geringere für größere Strukturen wie Oligomere). Wenn die native PAGE bei neutralem pH-Wert durchgeführt wird, um eine saure oder alkalische Denaturierung zu vermeiden, kann sie zur Untersuchung der Konformation, der Selbstassoziation oder Aggregation und der Bindung anderer Proteine oder Verbindungen verwendet werden.
Native Gele können also auf jeden Prozess reagieren, der entweder die Ladung oder die Konformation eines Proteins verändert. Dies macht sie zu ausgezeichneten Instrumenten für den Nachweis von Dingen wie:
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Ladungsveränderungen aufgrund von chemischem Abbau (z. B. Deamidierung)
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ungefaltete, „geschmolzene Kügelchen“ oder andere modifizierte Konformationen
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Oligomere und Aggregate (sowohl kovalent als auch nicht-kovalent)
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Bindungsereignisse (Protein-Protein oder Protein-Ligand)
Diese Eigenschaften, und ihr relativ hoher Durchsatz machen native Gele zu hervorragenden Werkzeugen für die Analyse von Proben mit beschleunigter Stabilität, den Nachweis der Vergleichbarkeit verschiedener Chargen oder Prozesse oder die Untersuchung der Auswirkungen von Hilfsstoffen.
Ein weiterer Vorteil nativer Gele besteht darin, dass Proteine nach der Trennung in ihrem nativen Zustand gewonnen werden können. Die Rückgewinnung aktiver biologischer Materialien muss jedoch möglicherweise vor einer Fixierung oder Färbung erfolgen.
Beachten Sie, dass die hier besprochenen nativen Gele jetzt manchmal als „klare native“ Gele bezeichnet werden. Sie unterscheiden sich prinzipiell von den so genannten „blauen nativen“ Gelen, die darauf angewiesen sind, dass die Bindung von Farbstoff dem Protein eine sehr hohe elektrische Ladung verleiht, die die Eigenladung des Polypeptids übersteigt. Wenn man davon ausgeht, dass die Menge des gebundenen Farbstoffs proportional zur Masse des Proteins ist, kann die mit diesem „blue native“-Protokoll beobachtete Mobilität zur Schätzung der molaren Masse durch Vergleich mit Proteinstandards verwendet werden, ähnlich wie bei der SDS-PAGE. Die Massenstandards, die zur Verwendung mit blauen nativen Gelen verkauft werden, können nicht zur Schätzung der Molmassen für die hier diskutierten echten nativen Gele verwendet werden.