Oberflächenplasmonenresonanz

Was ist Oberflächenplasmonenresonanz?

Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) ermöglicht den markierungsfreien Nachweis biomolekularer Wechselwirkungen in Echtzeit.
SPR tritt auf, wenn polarisiertes Licht auf eine elektrisch leitende Oberfläche an der Schnittstelle zwischen zwei Medien trifft. Dabei werden Wellen der Elektronenladungsdichte, so genannte Plasmonen, erzeugt, die die Intensität des reflektierten Lichts in einem bestimmten Winkel, dem so genannten Resonanzwinkel, im Verhältnis zur Masse auf der Sensoroberfläche verringern.

Biacore SPR-Systeme werden vor allem in der pharmazeutischen Entwicklung, der Qualitätskontrolle und der biowissenschaftlichen Grundlagenforschung eingesetzt.

Verfolgen Sie markierungsfreie Wechselwirkungen in Echtzeit

Bei Biacore-Assays werden Zielmoleküle, meist Proteine, auf einer präparierten Goldsensoroberfläche immobilisiert, und eine Probe, die einen potenziellen Wechselwirkungspartner in Lösung enthält, wird über die Oberfläche durch eine Reihe von Durchflusszellen injiziert.

Im Verlauf der Wechselwirkung wird polarisiertes Licht auf die Sensoroberfläche gerichtet und der Winkel der minimalen Intensität des reflektierten Lichts erfasst. Dieser Winkel ändert sich, wenn sich Moleküle binden und dissoziieren, und das Wechselwirkungsprofil wird so in Echtzeit in einem Sensorgramm aufgezeichnet.

Welche Art von Wechselwirkungen können untersucht werden?

Biacore-Systeme können verwendet werden, um Wechselwirkungen zu untersuchen, an denen (im Prinzip) jede Art von Molekül beteiligt ist, von organischen Verbindungen über Proteine, Nukleinsäuren, Glykoproteine und sogar Viren und ganze Zellen. Da die Reaktion ein Maß für die Änderung der Massenkonzentration ist, ist die Reaktion pro molare Einheit des Wechselwirkungspartners proportional zum Molekulargewicht (kleinere Moleküle ergeben geringere molare Reaktionen).

Es gibt keine untere Grenze für organische Moleküle mit den heutigen Instrumenten.

Welche Proben können verwendet werden?

Das SPR-Detektionsprinzip erfordert keine Markierung der Wechselwirkungspartner, und Messungen können an komplexen Gemischen, wie Zellkulturüberständen oder Zellextrakten, sowie an gereinigten Wechselwirkungspartnern durchgeführt werden. Die Identität des in einer komplexen Probenmatrix überwachten Wechselwirkungspartners wird durch die Wechselwirkungsspezifität des an die Oberfläche gebundenen Partners bestimmt. Das SPR-Detektionsprinzip ist nicht invasiv und funktioniert gleichermaßen bei klaren und farbigen oder undurchsichtigen Proben.

Wie werden Oberflächenplasmonenresonanzdaten angezeigt?

Biacore-Systeme überwachen die Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen, von denen eines an die Sensoroberfläche gebunden ist und das andere frei in Lösung vorliegt. Ein Sensorgramm ist ein Diagramm der Reaktion gegen die Zeit, das den Verlauf der Wechselwirkung zeigt. Diese Kurve wird im Verlauf einer Analyse direkt auf dem Computerbildschirm angezeigt.

Was wird im Sensorgramm angezeigt?

Während der Probeninjektion ist im Sensorgramm eine positive Reaktion zu sehen, da der Analyt (der Wechselwirkungspartner in Lösung in Biacore-basierten Assays) an den Liganden (den Wechselwirkungspartner, der an der Sensoroberfläche in Biacore-basierten Assays gebunden ist) bindet. Die Reaktion nimmt während der Dissoziation ab. Nach Abschluss eines Analysezyklus wird die Regenerationslösung über den Sensorchip geleitet, um den gebundenen Analyten zu entfernen und den nächsten Analysezyklus vorzubereiten.

Die schematische Abbildung unten zeigt ein Sensorgramm. Die Balken unter der Kurve zeigen die Lösungen an, die über die Sensoroberfläche laufen.

Welche Daten können aus einer Interaktion gewonnen werden?

Die Daten einer Interaktion werden in einem Sensorgramm dargestellt und liefern quantitative Daten über:

• Bindung
  Bindet der Interaktionspartner an das Zielmolekül?
• Spezifität
  Inwieweit reagiert ein Wechselwirkungspartner mit anderen Molekülen?
• Konzentration
  Wie viel von einem bestimmten Molekül ist vorhanden und aktiv?
• Kinetik
  Wie hoch sind die Assoziations- und Dissoziationsraten?
• Affinität
  Wie stark ist die Bindung?

Wie interpretiere ich ein Sensorgramm?

Die Form des Sensorgramms gibt Aufschluss über die Wechselwirkung. Nachfolgend sind einige Beispiele für die Interpretation von Sensorgrammformen dargestellt.