KOMMENTAR
Der Farbstoffausschluss ist ein einfaches und schnelles Verfahren zur Messung der Lebensfähigkeit von Zellen, das jedoch mit dem Problem behaftet ist, dass die Lebensfähigkeit indirekt über die Unversehrtheit der Zellmembran bestimmt wird. So ist es möglich, dass die Lebensfähigkeit einer Zelle (gemessen an der Wachstums- oder Funktionsfähigkeit) beeinträchtigt ist, obwohl ihre Membranintegrität (zumindest vorübergehend) erhalten bleibt. Umgekehrt kann die Integrität der Zellmembran gestört sein, obwohl die Zelle in der Lage ist, sich selbst zu reparieren und voll lebensfähig zu werden. Ein weiteres potenzielles Problem besteht darin, dass aufgrund der subjektiven Bewertung der Farbstoffaufnahme geringe Mengen an Farbstoffaufnahme, die auf eine Zellverletzung hinweisen, unbemerkt bleiben können. In dieser Hinsicht führt ein mit einem Fluoreszenzfarbstoff unter einem Fluoreszenzmikroskop durchgeführter Farbstoffausschluss routinemäßig dazu, dass mehr nicht lebensfähige Zellen mit Farbstoffaufnahme bewertet werden als Tests, die mit Trypanblau unter einem Transmissionsmikroskop durchgeführt werden.
Eine anspruchsvollere Methode zur Messung der Lebensfähigkeit von Zellen ist die Bestimmung des Farbstoffausschlusses mittels Durchflusszytometrie. Dazu kann Typanblau verwendet werden, da dieses Protein an Proteine bindet und dann ein Fluoreszenzsignal aussendet, das in einem Durchflusszytometer nachgewiesen werden kann (bei 660 nm, wenn es an Rinderserumalbumin gebunden ist) (Einzelheiten zur Verwendung von Trypanblau in der Durchflusszytometrie siehe Referenz 2). Alternativ kann der Ausschluss mit anderen Licht emittierenden Farbstoffen wie Propidiumjodid gemessen werden (siehe Abschnitt 5.4 für eine Beschreibung der Verwendung von Propridiumjodid zur Bewertung der Lebensfähigkeit von Zellen mittels durchflusszytometrischer Analyse). Ein detaillierter Vergleich der Schätzungen von lebenden und toten Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlusses, der wie hier beschrieben manuell ausgewertet wird, und der elektronischen Auswertung mittels Durchflusszytometrie zeigt, dass die beiden Techniken in erfahrenen Händen sehr ähnliche Ergebnisse liefern. Während die beschriebene Farbstoffausschlusstechnik aufgrund der Subjektivität des Anwenders eher zu Fehlern führen kann, ist der durchflusszytometrische Ansatz für die Bewertung der Lebensfähigkeit von Zellen während der Durchführung komplexer und zeitaufwändiger Zellreinigungstechniken weniger geeignet. Daher ist ein durchflusszytometrisches Verfahren nur dann anwendbar, wenn präzise Messungen der Anzahl toter Zellen in einem Zellgemisch erforderlich sind.
Kürzlich wurde über einen „automatisierten Fluoreszenzmikroskop-Viabilitätstest“ berichtet, bei dem die Zellviabilität unter Verwendung von Propidiumiodid in Verbindung mit einer Vorrichtung zur Zählung lebender und toter Zellen in einem tragbaren Mikroskop-Zellzähler, der mit einem Mikrochip ausgestattet ist, gemessen wird. Dieser Zähler soll in der Lage sein, die Lebensfähigkeit von Zellen schneller zu beurteilen als die hier beschriebene manuelle Technik oder das Durchflusszytometer und genauere und zuverlässigere Zählungen zu erhalten. Dieses Gerät kann in Situationen nützlich sein, in denen viele schnell zu erfassende Tests der Zelllebensfähigkeit erforderlich sind (3).
Es sei darauf hingewiesen, dass die Zelllebensfähigkeit auch mit Farbstoffen, die an die DNA binden (Ethidiummonoazid), mit Mitteln, die an Phosphatidylserin binden (Annexin V) und mit aminreaktiven Farbstoffen bewertet werden kann. Die Verwendung dieser alternativen Mittel erfordert in der Regel eine Durchflusszytometrie und ist daher nur unter bestimmten Bedingungen anwendbar.
Der Ausschluss von Trypanblau, wie im obigen Protokoll beschrieben, kann in 5 bis 10 Minuten durchgeführt werden.