PMC

Falldarstellung

Der vorliegende Fallbericht stammt von einem routinemäßigen tierärztlichen Besuch in einem Betrieb mit 155 Tieren und zwei Schafrassen (Pelifolk und Blackbelly) in Tesistán, Gemeinde Zapopan, Staat Jalisco, Mexiko. Die Anlagen dieses Betriebs wurden von einer früheren Schweinefarm übernommen und sind noch immer von Schweine- und Rinderfarmen in der näheren Umgebung umgeben. Die Herde wurde auf erhöhten Böden gehalten, um die Reinigung und Handhabung zu erleichtern, allerdings befanden sich viele geröstete scharfe Gegenstände (wie Draht, zerbrochene Zäune, Nägel usw.) in den Buchten, und die Reinigung wurde zum Zeitpunkt der Inspektion in dem Betrieb nicht ordnungsgemäß durchgeführt. Die Fütterung basierte auf lokal verfügbaren Futtermitteln wie minderwertigem Raufutter, Schweinemist-Silage und eiweißreichem kommerziellen Kraftfutter. Dieser Betrieb rief den Veterinärdienst an, weil bei den Tieren häufig Hautabszesse festgestellt wurden, wobei keine anderen Beschwerden im Zusammenhang mit Hautproblemen gemeldet wurden. Abszesse scheinen die Produktivität der Tiere nicht zu beeinträchtigen, allerdings wirkt sich das Vorhandensein solcher Läsionen negativ auf die Tiervermarktung aus, weshalb der Eigentümer daran interessiert war, den ätiologischen Erreger und die empfohlene Behandlung zur Beseitigung der Krankheit im Betrieb zu erfahren. Von 31 Tieren (29 Mutterschafen, 1 Schafbock und 1 Lamm) wurden von einem zertifizierten Tierarzt Proben entnommen und zur bakteriologischen Diagnose ins Labor geschickt, um die Erreger zu finden, die das Problem verursachten. Aufgrund des Aussehens der Abszesse lautete die Vermutungsdiagnose für die Infektion im Betrieb bei den meisten Tieren Caseous lymphadenitis. Die bakteriologische Analyse ergab jedoch, dass 13 Tiere mit C. pseudotuberculosis, 1 mit Corynebacterium spp., 2 mit Proteus spp. und 2 mit Streptococcus spp. infiziert waren, und in den übrigen 13 Fällen konnte der Erreger nicht identifiziert werden. Die Kategorisierung für das Corynebacterium spp. Isolat war unklar, da die Ergebnisse der bakteriologischen und biochemischen Tests nicht schlüssig waren.

Dieser Artikel beschreibt die Isolierung von C. xerosis aus einem 4 Monate alten Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) Lamm in guter Körperkondition. Nach unserem Kenntnisstand ist dies der erste Bericht über C. xerosis, der einen klinischen Hautabszess bei Schafen verursacht. Für die Veröffentlichung der Ergebnisse der klinischen Studie, einschließlich des Fotomaterials, wurde vom Eigentümer des Tieres eine informierte Zustimmung eingeholt. Das Tier wies einen Abszess von harter Konsistenz ohne Drainage an der linken Halsseite auf (Abb. 1a). Die erste klinische Diagnose deutete auf eine käsige Lymphadenitis hin, möglicherweise verursacht durch C. pseudotuberculosis. Eine Probe für die bakteriologische Analyse wurde durch Punktion des Abszesses mit einer sterilen 5-ml-Spritze mit einer 20-Gauge-Spritzenkanüle nach Reinigung und Desinfektion der Abszessoberfläche gewonnen. Das gewonnene Exsudat war serös und von weißem Aussehen. Die biologische Probe wurde bis zur biologischen Charakterisierung im Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 Straße Toluca-Atlacomulco, Toluca, Mexiko, z.c. 50200) bei 4 °C gelagert. Zwischen der Probenahme und der Verarbeitung lagen nicht mehr als 72 Stunden. Die Proben wurden in doppelter Ausführung in 8 %igem Schafsblutagar kultiviert und 24-48 Stunden bei 37 °C unter aeroben und mikroaerophilen Bedingungen bebrütet. Es wurden Kolonien mit einem Durchmesser von 1,0 mm, nicht hämolytisch, von gelblich-brauner Farbe und leicht trockenem Aussehen beobachtet (Abb. 2a). Diese morphologischen Merkmale entsprachen nicht denen, die zuvor für C. pseudotuberculosis beschrieben worden waren, sondern sie schienen eher Kolonien von C. xerosis zu sein. Mikroskopisch (10fache Vergrößerung; Abb. 2c) wurden die Bakterien als keulenförmig endende, pleomorphe, unregelmäßig gefärbte Gram-positive Stäbchen beobachtet. Die biochemischen Tests ergaben folgende Ergebnisse: Dreifachzucker-Eisen (TSI,-), Lysin-Eisen-Agar (LIA,-), Citrat-Test (CIT,-), Sulfid-Indol-Motilität (SIM,-), Motilität, Indol, Ornitin (MIO,-), Oxidativ-fermentativ (OF,-), Methylrot (-), Peptonwasser (-), Voger Pascaguer (-), Harnstoff (-), Nitratbouillon (+), Trehalose (+), Saccharose (+), Maltose (+) und Glucosefermentation (positiv bei 37 °C und negativ bei 42 °C). Diese Ergebnisse könnten einem C. pseudotuberculosis-Profil entsprechen, mit Ausnahme des Harnstofftests, der nicht positiv, sondern negativ ausfiel und daher eher mit einem C. xerosis-Profil übereinstimmt. Auch wenn das API-System nicht spezifisch für die Identifizierung von C. xerosis ist, haben wir beschlossen, das Isolat mit diesem System zu untersuchen, um zu sehen, ob es als andere Corynebacterium-Spezies identifiziert werden kann. Um herauszufinden, ob das Isolat zu anderen Arten wie C. freneyi und C. amycolatum gehört, die bei Schafen selten vorkommen, haben wir außerdem getestet, ob die Kolonie bei 20 °C wachsen und bei 42 °C Glukose vergären kann. Das Isolat wuchs bei 20 °C gut und fermentierte bei 42 °C keine Glukose, beides Merkmale, die mit C. xerosis und C. hansenii in Verbindung gebracht werden, weshalb wir beschlossen, eine molekulare Analyse durchzuführen, um herauszufinden, ob wir das Isolat molekular als C. xerosis identifizieren können. Wir analysierten drei Loci, um unsere Diagnosegenauigkeit zu erhöhen. Wir testeten auf ein Gen, das normalerweise bei C. xerosis fehlt, aber bei C. pseudotuberculosis vorhanden ist, das pld-Gen, von dem wir erwarteten, dass es nach dem PCR-Test kein Amplikon enthält, wenn es sich um C. xerosis handelt, im Gegensatz zu C. pseudotuberculosis, das eine 203 bp-Bande amplifiziert; ein zweiter Locus zielte auf die Amplifikation der intergenen Spacer-Region der 16S-23S rRNA-Gene (16S-23S) ab, wobei Primer verwendet wurden, die für C. pseudotuberculosis entwickelt wurden und von denen berichtet wurde, dass sie bei C. xerosis nicht funktionieren, und wir würden auch keine Amplifikationsbande für C. xerosis und eine 816 bp-Bande für C. pseudotuberculosis erwarten. Schließlich führten wir eine PCR-Amplifikation und Sequenzierung des rpoB-Gens (446 bp) durch, von dem bereits berichtet wurde, dass es zur Unterscheidung von Corynebacterium-Arten dient. Die DNA-Extraktion erfolgte mit einem kommerziellen Kit (KAPA Express Extract) nach dem Protokoll des Herstellers. Eine Multiplex-PCR-Technik zur Amplifikation von Teilsequenzen der pld-, 16S-23S- und rpoB-Gene wurde nach dem von Pacheco (2007) veröffentlichten Protokoll durchgeführt. Die Reaktionen wurden mit einem handelsüblichen Multiplex-PCR-Kit (QIAGEN Multiplex PCR) nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die PCR-Analyse umfasste die folgenden Proben: Das zu charakterisierende Isolat, das mutmaßliche C. xerosis-Isolat und zwei C. pseudotuberculosis (ein lokales Isolat, das zuvor als biovar ovis charakterisiert wurde, und ein Referenzstamm, ATCC 43924, biovar equi), die als Kontrollen verwendet wurden. Wie für den mutmaßlichen C. xerosis erwartet, wurde eine einzelne PCR-Amplikonbande von 446 bp amplifiziert, die dem rpoB-Genfragment entspricht, und die intergenen 16S-23S-Gen- und pld-Genfragmente wurden nicht amplifiziert. Wie erwartet zeigten beide C. pseudotuberculosis-Stämme drei Banden von 203, 446 und 816 bp, die den Genen pld, rpoB bzw. 16S entsprechen (Abb. 3). Die RpoB-Genamplikons aller drei Proben wurden mit dem Promega-Reinigungskit (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) gereinigt und zur automatischen Sequenzierung an Macrogen (Rockville, MD, USA) geschickt. Multiple Sequenzalignments aus BLAST (NCBI) wurden zusammen mit den Sequenzen unserer Isolate mit der Clustal-W-Analyse von Mega 6.0.6 analysiert (Abb. 4). Die phylogenetische Analyse wurde mit der Methode der Nachbarschaftsverbindung (MEGA-Software 6.0.6) durchgeführt. Die Bootstrap-Werte wurden durch die Erzeugung von 1000 Zufallsbäumen ermittelt. In die phylogenetische Analyse wurden auch die Sequenzen des rpoB-Gens von C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) und C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2) einbezogen. Es konnten verschiedene phylogenetische Gruppen beobachtet werden, die bestimmten Corynebacterium-Arten entsprachen. Diese Ergebnisse bestätigen, dass es sich bei dem Isolat aus dieser Studie (rpoB C53) um C. xerosis handelt (Abb. 4).

Genotypisierungstechniken wie PCR sowie die Sequenzanalyse des rpoB C53-Isolats in dieser Studie trugen wesentlich zur korrekten Artidentifizierung bei, die ursprünglich irreführend war, wenn man phänotypische mikroskopische und biochemische Merkmale verwendete. Corynebacterium xerosis wurde bereits in klinischen Proben von Menschen in Läsionen bei Endokarditis, Pneumonitis, Osteomyelitis und Hautinfektionen, insbesondere bei immungeschwächten Patienten, nachgewiesen. Er wurde auch in klinischen Proben von Tieren gefunden, z. B. in Leberläsionen von Ziegen (Verdacht auf Pseudotuberkulose) und in Kuhmilch von Tieren mit Mastitis. Bei Schweinen wurde C. xerosis aus Läsionen in verschiedenen Geweben wie Leber, Niere, Lunge, Milz und Gelenken sowie aus subkutanen Abszessen isoliert. Außerdem wurde C. xerosis bei Schafen aus klinischen Proben der Gebärmutter bei einem Abort und aus Lungengewebe von Tieren mit Atemproblemen isoliert. Diese Isolate wurden durch Amplifikation des rRNA 16S-23S-Gens mittels PCR-RFLP identifiziert und charakterisiert. In diesen Studien war es jedoch nicht möglich, ein Bandenmuster zu erhalten, das eindeutig genug war, um C. xerosis von anderen Corynebacterium-Arten zu unterscheiden. Die Autoren führten auch eine Analyse und einen Sequenzvergleich der Gene 16S und rpoB durch, was es ihnen ermöglichte, C. xerosis von anderen Arten zu unterscheiden, die Corynebacterium genetisch ähnlich sind.

Wie bereits erwähnt, wurde diese Studie auf der Grundlage des rpoB-Gens durchgeführt, das von anderen Autoren als das Gen der Wahl für die phylogenetische Analyse der Gattung Corynebacterium bezeichnet wurde, da es einen hohen Polymorphismus aufweist, der sogar größer ist als die intergene Spacerregion der 16S-23S rRNA-Gene . Es ist bekannt, dass Hautabszesse bei Schafen (käsige Lymphadenitis) durch C. pseudotuberculosis verursacht werden und dass der Hauptfaktor für Virulenz und Pathogenität das Exotoxin Phospholipase D ist, das durch das pld-Gen kodiert und in der Zellmembran des Bakteriums exprimiert wird. Dieses Exotoxin ist ein Permeabilitätsfaktor, der die Hydrolyse der Esterbindungen des Sphingomyelins in Säugetierzellmembranen fördert und möglicherweise zur Ausbreitung der Bakterien vom ursprünglichen Infektionsort zu sekundären Stellen über das Lymphsystem zu den regionalen Ganglien beiträgt; außerdem scheint es an der Verringerung der Lebensfähigkeit von Makrophagen nach der Infektion beteiligt zu sein. Das Exotoxin verursacht auch dermonekrotische Läsionen. Dieses Exotoxin wurde jedoch bei C. xerosis nicht als pathogenes Toxin nachgewiesen, das zur Entstehung von Abszessen beitragen könnte. Dies macht deutlich, wie wichtig es ist, die Infektionsmechanismen dieser Corynebacterium-Spezies weiter zu erforschen.

Ein wichtiger Diskussionspunkt epidemiologischer Natur ist die Tatsache, dass das Produktionssystem für Schafe, aus dem die Probe stammt, zuvor für Schweine verwendet wurde, eine Spezies, bei der C. xerosis als häufiger Erreger gemeldet wurde. Außerdem enthält einer der Hauptbestandteile des Schafsfutters Schweinenebenprodukte (Schweinegülle), die möglicherweise aktive Krankheitserreger enthalten, darunter auch Corynebacterium spp. Darüber hinaus sind scharfe Gegenstände wie Metallstangen, Nägel und Drähte in den Anlagen weit verbreitet, was die Verletzungsgefahr für die Tiere erhöht und Corynebacterium spp. den Weg in den Organismus ebnet, darunter auch C. xerosis. All diese Faktoren könnten zum Auftreten von C. xerosis in der Anlage beigetragen haben. Es wurden keine weiteren Untersuchungen durchgeführt, jedoch wurde dem Besitzer empfohlen, Abszesse bei allen Tieren in einem infektionssicheren Bereich zu entfernen und zu desinfizieren (um eine Ausbreitung der Erreger zu vermeiden), die Buchten zu verstärken und alle scharfen Kanten und Gegenstände von den Zäunen, Tränken und Böden zu entfernen. Da es sich sowohl bei C. xerosis als auch bei C. pseudotuberculosis um potenziell zoonotische Mikroorganismen handelt, wurde dem Landwirt empfohlen, beim Umgang mit den Tieren und den im Betrieb anfallenden Abfällen extreme Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, um eine Infektion von Mensch und Tier und die mögliche Verbreitung des Mikroorganismus in anderen Betrieben zu verhindern.