Ein Ansatz zur Vermeidung von PDs besteht in der physikalisch-chemischen Optimierung des PCR-Systems, d.h. Änderung der Konzentrationen von Primern, Magnesiumchlorid, Nukleotiden, Ionenstärke und Temperatur der Reaktion. Diese Methode ist durch die physikalisch-chemischen Eigenschaften, die auch die Effizienz der Amplifikation der Zielsequenz in der PCR bestimmen, etwas eingeschränkt. Daher kann eine Verringerung der PD-Bildung auch zu einer geringeren PCR-Effizienz führen. Um diese Einschränkung zu überwinden, zielen andere Methoden darauf ab, nur die Bildung von PDs zu reduzieren, einschließlich des Primer-Designs und der Verwendung verschiedener PCR-Enzymsysteme oder -Reagenzien.
Primer-Design-SoftwareEdit
Primer-Design-Software verwendet Algorithmen, die das Potenzial der DNA-Sekundärstrukturbildung und das Annealing von Primern an sich selbst oder innerhalb von Primer-Paaren überprüfen. Physikalische Parameter, die von der Software berücksichtigt werden, sind die potenzielle Selbstkomplementarität und der GC-Gehalt der Primer, ähnliche Schmelztemperaturen der Primer und das Fehlen von Sekundärstrukturen, wie z. B. Stammschleifen, in der DNA-Zielsequenz.
Hot-start PCREdit
Da die Primer so konzipiert sind, dass sie eine geringe Komplementarität zueinander aufweisen, können sie nur bei niedriger Temperatur, z. B. Raumtemperatur, annealing (Schritt I in der Abbildung), wie z. B. während der Vorbereitung der Reaktionsmischung. Obwohl die in der PCR verwendeten DNA-Polymerasen bei etwa 70 °C am aktivsten sind, haben sie auch bei niedrigeren Temperaturen eine gewisse Polymerisationsaktivität, die eine DNA-Synthese aus den Primern nach dem Aneinanderfügen bewirken kann. Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um die Bildung von PDs zu verhindern, bis die Reaktion die Arbeitstemperatur (60-70 °C) erreicht. Dazu gehören die anfängliche Hemmung der DNA-Polymerase oder die physikalische Trennung der Reaktionskomponenten, bis die Reaktionsmischung die höheren Temperaturen erreicht. Diese Methoden werden als Hot-Start-PCR bezeichnet.
Wachs: Bei dieser Methode wird das Enzym räumlich von der Reaktionsmischung durch Wachs getrennt, das schmilzt, wenn die Reaktion eine hohe Temperatur erreicht.
Slow release of magnesium: Da die DNA-Polymerase für ihre Aktivität Magnesiumionen benötigt, wird das Magnesium durch Bindung an eine chemische Verbindung chemisch von der Reaktion abgetrennt und erst bei hoher Temperatur in die Lösung freigesetzt.
Nicht-kovalente Bindung eines Inhibitors: Bei dieser Methode werden ein Peptid, ein Antikörper oder ein Aptamer bei niedriger Temperatur nicht-kovalent an das Enzym gebunden und hemmen dessen Aktivität. Nach einer Inkubation von 1-5 Minuten bei 95 °C wird der Inhibitor freigesetzt und die Reaktion beginnt.
Kälteempfindliche Taq-Polymerase: ist eine modifizierte DNA-Polymerase, die bei niedrigen Temperaturen fast nicht aktiv ist.
Chemische Modifikation: bei dieser Methode wird ein kleines Molekül kovalent an die Seitenkette einer Aminosäure im aktiven Zentrum der DNA-Polymerase gebunden. Das kleine Molekül wird vom Enzym freigesetzt, indem das Reaktionsgemisch 10-15 Minuten lang bei 95 °C inkubiert wird. Sobald das kleine Molekül freigesetzt ist, wird das Enzym aktiviert.
Strukturelle Modifikationen von PrimernEdit
Ein weiterer Ansatz zur Verhinderung oder Verringerung der PD-Bildung besteht darin, die Primer so zu modifizieren, dass das Annealing mit sich selbst oder untereinander keine Verlängerung verursacht.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): ein Nukleotidschwanz, der komplementär zum 3′-Ende des Primers ist, wird an das 5′-Ende des Primers angefügt. Aufgrund der unmittelbaren Nähe des 5′-Schwanzes bindet er an das 3′-Ende des Primers. Das Ergebnis ist ein Stem-Loop-Primer, der das Annealing mit kürzeren Überlappungen ausschließt, aber das Annealing des Primers an seine vollständig komplementäre Sequenz im Ziel ermöglicht.
Chimäre Primer: Einige DNA-Basen im Primer werden durch RNA-Basen ersetzt, wodurch eine chimäre Sequenz entsteht. Die Schmelztemperatur einer chimären Sequenz mit einer anderen chimären Sequenz ist niedriger als die einer chimären Sequenz mit DNA. Dieser Unterschied ermöglicht es, die Annealing-Temperatur so einzustellen, dass der Primer an seine Zielsequenz annealing, nicht aber an andere chimäre Primer.
Blockade-abspaltbare Primer: Eine Methode, die als RNase H-abhängige PCR (rhPCR) bekannt ist, verwendet eine thermostabile RNase HII, um eine Blockierungsgruppe von den PCR-Primern bei hoher Temperatur zu entfernen. Dieses RNase-HII-Enzym zeigt bei niedrigen Temperaturen fast keine Aktivität, so dass die Entfernung der Blockade nur bei hohen Temperaturen erfolgt. Das Enzym besitzt auch eine inhärente Primer:Template-Mismatch-Diskriminierung, was zu einer zusätzlichen Selektion gegen Primer-Dimere führt.
Verhinderung der Signalerfassung durch Primer-DimereBearbeiten
Während die oben genannten Methoden darauf abzielen, die PD-Bildung zu reduzieren, zielt ein anderer Ansatz darauf ab, das von PDs erzeugte Signal in der quantitativen PCR zu minimieren. Dieser Ansatz ist nützlich, solange nur wenige PDs gebildet werden und ihre hemmende Wirkung auf die Produktakkumulation gering ist.
Vierstufige PCR: wird verwendet, wenn mit unspezifischen Farbstoffen wie SYBR Green I gearbeitet wird. Sie basiert auf der unterschiedlichen Länge und damit unterschiedlichen Schmelztemperatur der PDs und der Zielsequenz. Bei dieser Methode wird das Signal unterhalb der Schmelztemperatur der Zielsequenz, aber oberhalb der Schmelztemperatur der PDs erfasst.
Sequenzspezifische Sonden: TaqMan- und molekulare Beacon-Sonden erzeugen nur in Anwesenheit ihrer (komplementären) Zielsequenz ein Signal, und diese erhöhte Spezifität schließt die Signalerfassung (aber nicht mögliche hemmende Auswirkungen auf die Produktakkumulation) durch PDs aus.