Beschreibung
T7-Promotoren können in E. coli hohe Transkriptionsraten erzeugen, wenn T7 RNAP vorhanden ist. Der zweite Vorteil von T7-Promotoren ist, dass sie von E. coli RNAP nicht erkannt werden, wodurch T7-Promotoren unabhängig von E. coli-Promotoren reguliert werden können. Da ein aktiver starker T7-Promotor das Wachstum von E. coli aufgrund des hohen Ressourcenverbrauchs (z. B. Nukleotide) durch das T7-RNAP vollständig stoppen kann, ist es in der Regel erforderlich, entweder das T7-RNAP oder den T7-Promotor oder beide zu regulieren. Die T7-Promotorfamilie enthält daher sowohl konstitutive Promotoren als auch negativ regulierte Promotoren, die durch ein Repressorprotein ausgeschaltet werden können. Der am häufigsten verwendete Zellstamm für ein T7-Promotorsystem ist BL21(DE3), ein E. coli B-Stamm, der ein λ-Lysogen mit einem induzierbaren T7-RNAP-Gen auf dem Chromosom enthält. Es ist jedoch möglich, viele andere E. coli-Stämme so zu verändern, dass sie T7 RNAP bedingt exprimieren.
Beschaffung der T7-Promotoren-Sammlung
Die Sequenzen der T7-Promotoren sind in der nachstehenden Tabelle zu finden. Um die physische DNA zu erhalten, empfehlen wir zwei Vorgehensweisen:
Durch De-novo-Synthese: Da es sich bei den Promotoren um relativ kurze Sequenzen handelt, können sie in Form von zwei einzelsträngigen, überlappenden Oligos bestellt werden, die annealed und verlängert werden, um die vollständigen Promotoren zu konstruieren. Siehe dieses OpenWetWare-Protokoll zur Konstruktion von Teilen durch Oligo-Annealing und -Extension. Alternativ können die Promotoren auch als kurze Gene bei einer Firma wie Geneart
über die Registry Distribution bestellt werden: Einige der Promotoren sind in der aktuellen Registry-Distribution verfügbar, siehe die Verfügbarkeits-Spalte in der Tabelle unten.
Design &Konstruktion
Das Sequenzlogo für die starken Promotoren aus dem Bakteriophagen T7-Genom.
Die T7-Promotoren in der Sammlung wurden von mehreren verschiedenen Gruppen entworfen und konstruiert. Allerdings gibt es nur T7 RNAP und damit nur eine Art von T7-Promotor. Die Konsenssequenz für T7-Promotoren kann aus dem rechts abgebildeten Sequenzlogo für T7-Promotoren abgeleitet werden.
T7-Promotorensammlung
| Name | Beschreibung | Promotorsequenz | Positive Regulatoren |
Negative Regulatoren |
Länge | Doc | Status | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| BBa_I712074 | T7-Promotor (starker Promotor von T7-Bakteriophagen) | . . . agggaatacaagctacttgttctttttgca | 46 | 1938 | Auf Lager | |||
| BBa_I719005 | T7 Promoter | taatacgactcactatagggaga | 23 | 7912 | Auf Lager | |||
| BBa_J34814 | T7 Promoter | gaatttaatacgactcactatagggaga | 28 | 1190 | Nicht vorrätig | |||
| BBa_J64997 | T7 Konsensus -10 und Rest | taatacgactcactatagg | 19 | 10154 | Es ist kompliziert | |||
| BBa_K113010 | überlappender T7-Promotor | . . gagtcgtattaatacgactcactatagggg | 40 | 1553 | Es ist kompliziert | |||
| BBa_K113011 | mehr überlappender T7-Promotor | . . agtgagtcgtactacgactcactatagggg | 37 | 1601 | Es ist kompliziert | |||
| BBa_K113012 | schwächer überlappender T7-Promotor | . gagtcgtattaatacgactctctatagggg | 40 | 1630 | Es ist kompliziert | |||
| BBa_K1614000 | T7-Promotor für Expression von funktioneller RNA | taatacgactcactatag | 18 | 5219 | Auf Lager | |||
| BBa_K3511008 | C62-T7-Promoter | taatacgactcacaatcgcggag | 23 | |||||
| BBa_K3633015 | T7-Promoter | taatacgactcactatagg | 19 | Es ist kompliziert | ||||
| BBa_K525998 | Promotor T7 und RBS | . . . atacgactcactatagggaaagaggagaaa | 32 | 3036 | Auf Lager | |||
| BBa_R0085 | T7 Consensus Promoter Sequence | taatacgactcactatagggaga | 23 | 2072 | Auf Lager | |||
| BBa_R0180 | T7 RNAP-Promotor | ttatacgactcactatagggaga | 23 | 1654 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_R0181 | T7 RNAP-Promotor | gaatacgactcactatagggaga | 23 | 1651 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_R0182 | T7 RNAP Promoter | taatacgtctcactatagggaga | 23 | 1653 | Nicht vorrätig | |||
| BBa_R0183 | T7 RNAP Promotor | tcatacgactcactatagggaga | 23 | 1653 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_R0184 | T7-Promotor (lacI repressibel) | . . ataggggaattgtgagcggataacaattcc | 44 | 1176 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_R0185 | T7-Promotor (lacI-repressibel) | . . ataggggaattgtgagcggataacaattcc | 44 | 1888 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_R0186 | T7-Promotor (lacI-repressibel) | . . ataggggaattgtgagcggataacaattcc | 44 | 1885 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_R0187 | T7-Promotor (lacI-repressibel) | . . ataggggaattgtgagcggataacaattcc | 44 | 1885 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_Z0251 | T7-Promotor stark | . . taatacgactcactatagggagaccacaac | 35 | 1887 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_Z0252 | T7 schwache Bindung und Prozessivität | . . taattgaactcactaaagggagaccacagc | 35 | 1667 | Nicht auf Lager | |||
| BBa_Z0253 | T7 schwache Bindung Promotor | . . cgaagtaatacgactcactattagggaaga | 35 | 1400 | Nicht vorrätig |