En 1979, Marshall fue nombrado médico titular en el Royal Perth Hospital. Conoció a Robin Warren, un patólogo interesado en la gastritis, durante su formación en medicina interna en el Royal Perth Hospital en 1981. Juntos estudiaron la presencia de bacterias espirales en relación con la gastritis. En 1982, realizaron el primer cultivo de H. pylori y desarrollaron su hipótesis relacionada con la causa bacteriana de la úlcera péptica y el cáncer gástrico. Se ha afirmado que la teoría del H. pylori fue ridiculizada por científicos y médicos establecidos, que no creían que ninguna bacteria pudiera vivir en el entorno ácido del estómago. Se cita a Marshall diciendo en 1998 que «todo el mundo estaba en mi contra, pero yo sabía que tenía razón». Por otra parte, también se ha argumentado que los investigadores médicos mostraron un grado adecuado de escepticismo científico hasta que la hipótesis del H. pylori pudo ser apoyada con pruebas.
En 1982 Marshall y Warren obtuvieron financiación para un año de investigación. Las primeras 30 de las 100 muestras no mostraron ningún apoyo a su hipótesis. Sin embargo, se descubrió que los técnicos de laboratorio habían estado tirando los cultivos después de 2 días. Esta era la práctica habitual para los hisopos de garganta, donde otros organismos en la boca hacían que los cultivos no fueran útiles después de 2 días. Debido a otros trabajos del hospital, los técnicos de laboratorio no tuvieron tiempo de desechar inmediatamente la prueba 31 al segundo día, por lo que permaneció desde el jueves hasta el lunes. En esta muestra, descubrieron la presencia de H. pylori. Resulta que el H. pylori crece más lentamente que en 2 días, y también que los cultivos de estómago no están contaminados por otros organismos.
En 1983 presentaron sus descubrimientos hasta el momento a la Sociedad Gastroenterológica de Australia, pero los revisores rechazaron su trabajo, calificándolo en el 10% inferior de los que recibieron en 1983.
Después de los intentos fallidos de infectar a los lechones en 1984, Marshall, tras hacerse una endoscopia de referencia, bebió un caldo que contenía H. pylori cultivado, esperando desarrollar, quizás años después, una úlcera. Se sorprendió cuando, sólo tres días después, desarrolló unas vagas náuseas y halitosis (debido a la aclorhidria, no había ácido para matar las bacterias en el estómago, y sus productos de desecho se manifestaban como mal aliento), que sólo notó su madre. En los días 5-8, desarrolló vómitos aclorhídricos (sin ácido). El octavo día, se le repitió la endoscopia, que mostró una inflamación masiva (gastritis), y una biopsia de la que se cultivó H. pylori, mostrando que había colonizado su estómago. El decimocuarto día después de la ingestión, se realizó una tercera endoscopia y Marshall empezó a tomar antibióticos. Marshall no desarrolló anticuerpos contra H. pylori, lo que sugiere que la inmunidad innata puede a veces erradicar la infección aguda por H. pylori. La enfermedad de Marshall y su recuperación, basada en un cultivo de organismos extraídos de un paciente, cumplía los postulados de Koch para el H. pylori y la gastritis, pero no para la úlcera péptica. Este experimento se publicó en 1985 en el Medical Journal of Australia y se encuentra entre los artículos más citados de la revista.
Después de su trabajo en el Hospital de Fremantle, Marshall investigó en el Royal Perth Hospital (1985-86) y en la Universidad de Virginia, Estados Unidos (1986-actualidad), antes de regresar a Australia mientras permanecía en la facultad de la Universidad de Virginia. De 1998 a 2003 fue becario Burnet en la Universidad de Australia Occidental (UWA). Marshall sigue investigando en relación con el H. pylori y dirige el Laboratorio de Investigación del H. pylori en la UWA.
En 2007, Marshall aceptó un nombramiento a tiempo parcial en la Universidad Estatal de Pensilvania.
En agosto de 2020, Barry Marshall, junto con Simon J. Thorpe, aceptó un puesto en el consejo asesor científico de Brainchip INC, una empresa de chips informáticos.