Un método para evitar los DP consiste en la optimización físico-química del sistema de PCR, es decir, cambiando las concentraciones de cebadores, cloruro de magnesio, nucleótidos, fuerza iónica y temperatura de la reacción. Este método está algo limitado por las características físico-químicas que también determinan la eficacia de la amplificación de la secuencia objetivo en la PCR. Por lo tanto, la reducción de la formación de PDs también puede resultar en una reducción de la eficiencia de la PCR. Para superar esta limitación, otros métodos tienen como objetivo reducir únicamente la formación de PDs, incluyendo el diseño de cebadores, y el uso de diferentes sistemas de enzimas de PCR o reactivos.
Software de diseño de cebadoresEditar
El software de diseño de cebadores utiliza algoritmos que comprueban el potencial de formación de la estructura secundaria del ADN y el recocido de los cebadores a sí mismo o dentro de los pares de cebadores. Los parámetros físicos que tiene en cuenta el software son la posible autocomplementariedad y el contenido de GC de los cebadores; las temperaturas de fusión similares de los cebadores; y la ausencia de estructuras secundarias, como bucles de tallo, en la secuencia diana de ADN.
PCREdit
Debido a que los cebadores se diseñan para tener una baja complementariedad entre sí, es posible que se recoja (paso I en la figura) sólo a baja temperatura, por ejemplo, la temperatura ambiente, como durante la preparación de la mezcla de reacción. Aunque las ADN polimerasas utilizadas en la PCR son más activas en torno a los 70 °C, tienen cierta actividad polimerizadora también a temperaturas más bajas, lo que puede provocar la síntesis de ADN a partir de los cebadores tras el recocido entre ellos. Se han desarrollado varios métodos para evitar la formación de DP hasta que la reacción alcance la temperatura de trabajo (60-70 °C), y estos incluyen la inhibición inicial de la ADN polimerasa, o la separación física de los componentes de la reacción hasta que la mezcla de reacción alcance las temperaturas más altas. Estos métodos se denominan PCR de arranque en caliente.
Cera: en este método, la enzima se separa espacialmente de la mezcla de reacción mediante cera que se funde cuando la reacción alcanza una temperatura elevada.
Liberación lenta de magnesio: La ADN polimerasa requiere iones de magnesio para su actividad, por lo que el magnesio se separa químicamente de la reacción mediante la unión a un compuesto químico, y se libera en la solución sólo a alta temperatura.
Unión no covalente del inhibidor: en este método un péptido, anticuerpo o aptámero se unen de forma no covalente a la enzima a baja temperatura e inhiben su actividad. Tras una incubación de 1 a 5 minutos a 95 °C, el inhibidor se libera y se inicia la reacción.
Taq polimerasa sensible al frío: es una ADN polimerasa modificada con una actividad casi nula a baja temperatura.
Modificación química: en este método se une covalentemente una pequeña molécula a la cadena lateral de un aminoácido en el sitio activo de la ADN polimerasa. La pequeña molécula se libera de la enzima mediante la incubación de la mezcla de reacción durante 10-15 minutos a 95 °C. Una vez liberada la pequeña molécula, la enzima se activa.
Modificaciones estructurales de los cebadoresEditar
Otro enfoque para prevenir o reducir la formación de DP es modificando los cebadores para que el recocido entre ellos mismos o entre sí no provoque la extensión.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): una cola de nucleótidos, complementaria al extremo 3′ del cebador se añade al extremo 5′ del mismo. Debido a la proximidad de la cola 5′, ésta se une al extremo 3′ del cebador. El resultado es un cebador de bucle de vástago que excluye el recocido que implica solapamientos más cortos, pero permite el recocido del cebador a su secuencia totalmente complementaria en la diana.
Cebadores quiméricos: algunas bases de ADN en el cebador se sustituyen por bases de ARN, creando una secuencia quimérica. La temperatura de fusión de una secuencia quimérica con otra secuencia quimérica es menor que la de la secuencia quimérica con el ADN. Esta diferencia permite establecer la temperatura de recocido de forma que el cebador se recoja con su secuencia objetivo, pero no con otros cebadores quiméricos.
Cebadores bloqueables: un método conocido como PCR dependiente de RNasa H (rhPCR), utiliza una RNasa HII termoestable para eliminar un grupo bloqueante de los cebadores de la PCR a alta temperatura. Esta enzima RNasa HII no muestra casi ninguna actividad a baja temperatura, por lo que la eliminación del bloqueo sólo se produce a alta temperatura. La enzima también posee una discriminación inherente entre el cebador y la plantilla, lo que resulta en una selección adicional contra los dímeros del cebador.
Prevención de la adquisición de la señal de los dímeros del cebadorEditar
Mientras que los métodos anteriores están diseñados para reducir la formación de DP, otro enfoque tiene como objetivo minimizar la señal generada por los DP en la PCR cuantitativa. Este enfoque es útil siempre que se formen pocas PD y su efecto inhibidor sobre la acumulación de producto sea menor.
PCR de cuatro pasos: se utiliza cuando se trabaja con colorantes inespecíficos, como SYBR Green I. Se basa en la diferente longitud, y por tanto, diferente temperatura de fusión de las PD y la secuencia diana. En este método la señal se adquiere por debajo de la temperatura de fusión de la secuencia diana, pero por encima de la temperatura de fusión de las DP.
Sondas específicas de secuencia: Las sondas TaqMan y de baliza molecular generan señal sólo en presencia de su secuencia diana (complementaria), y esta especificidad mejorada excluye la adquisición de señal (pero no los posibles efectos inhibitorios sobre la acumulación de producto) de las PDs.