Como regente de Escocia
Después de la muerte de Jacobo, María de Guisa creyó que sería nombrada regente, pero el papel fue otorgado a James Hamilton, conde de Arran. Arran era partidario de la Inglaterra protestante. Llegó a un acuerdo para que la joven María se casara con el príncipe Eduardo de Inglaterra cuando cumpliera 10 años, que María de Guisa rechazó. Enrique VIII de Inglaterra se embarcó en una serie de ataques salvajes contra Escocia, a menudo conocidos como el rudo cortejo, destinados a forzar a los escoceses a permitir el matrimonio. En respuesta, en 1548 María de Guisa dispuso que la joven reina María viajara a Francia y fuera preparada para casarse con el Delfín Francisco, fortaleciendo aún más los lazos con Francia. Los franceses, a cambio, proporcionaron apoyo militar a los escoceses.
No fue hasta el 12 de abril de 1554, después de varios años de malestar con Inglaterra, que María de Guisa pudo finalmente arrebatar el control a Lord Arran y ser nombrada Reina Regente de Escocia. Durante su etapa como regente de Escocia, María de Guisa se enfrentó a constantes conflictos. Su objetivo era modernizar Escocia manteniéndola católica y libre de la interferencia inglesa, pero había muchos escoceses partidarios de Inglaterra y del movimiento protestante que se resistían a sus esfuerzos.
La reforma protestante era fuerte en ese momento. Uno de estos reformistas fue John Knox, que predicaba contra la regencia de María y quería derrocarla para establecer la iglesia protestante en Escocia. Liderados por un grupo de nobles llamados los Señores de la Congregación, los partidarios de Inglaterra continuaron rebelándose contra María de Guisa. Desconfiaban de sus continuos lazos con la Francia católica, reforzados por el matrimonio de su hija con Francisco en 1558.
Los protestantes siguieron ganando fuerza y lideraron revueltas contra María de Guisa. María se enfrentó a los Señores Protestantes de la Congregación en Perth el 22 de mayo de 1559, pero tuvo que retirarse a Edimburgo donde, con la ayuda de las tropas francesas reconquistó la ciudad, después de que Knox y los reformistas protestantes pidieran su destitución.
Para empeorar las cosas, Inglaterra, ahora gobernada por la reina Isabel I, siguió enviando refuerzos para sacar a los soldados franceses de Escocia y continuaron los combates esporádicos.