El ensayo de migración Transwell es una técnica clásica que permite a los científicos cuantificar el movimiento celular. La migración se refiere a la capacidad de una célula para moverse individualmente o en grupos. Los movimientos celulares son posibles gracias a la reestructuración precisa de su citoesqueleto y la migración suele producirse en respuesta a estímulos que actúan como señales.
Hoy hablaremos del ensayo de migración transwell, que utiliza una sencilla configuración de cámara para evaluar la migración en respuesta a señales de atracción.
Comenzaremos proporcionando algunos antecedentes sobre la cámara transwell.
El aparato fue diseñado por primera vez por el Dr. Stephen Boyden en 1961, quien lo utilizó para estudiar la migración de leucocitos. Por lo tanto, este método también se conoce como ensayo de cámara Boyden.
En una cámara Boyden simple, la pared exterior es de los pocillos, como los de una placa de 96 pocillos. Dentro de cada pocillo, se coloca un transwell, que es un inserto cilíndrico. El inserto tiene una membrana de policarbonato con un tamaño de poro definido. Cuando se coloca en el pocillo, divide la cámara en dos compartimentos. El compartimento superior es donde se sembrarán las células cuyo comportamiento migratorio se va a estudiar, y el depósito inferior es donde se coloca la solución de quimioatrayente. Por definición, un quimioatrayente es una molécula que tiene la capacidad de promover la motilidad celular «atrayendo a las células»
Debido a estas fuerzas de atracción, las células del compartimento superior migran a través de los poros hacia el depósito inferior. Si las células tienen propiedades adherentes, como algunas células de melanoma, tras el movimiento se «pegarán» a la parte inferior de la membrana. En este caso, se puede fijar la membrana, teñirla y contar las células al microscopio. Por otro lado, las células no adherentes, como los espermatozoides, migrarán al depósito inferior. En este caso, las células en la solución del depósito pueden contarse con la ayuda de un hemocitómetro.
Aunque el montaje de este ensayo es sencillo, hay varias cosas que hay que tener en cuenta antes del experimento. Repasemos algunos de ellos.
Comenzando por la solución de siembra, hay que asegurarse de que la densidad está optimizada para observar la migración celular. Un número demasiado bajo de células puede dar lugar a una migración indetectable, y densidades mayores superpoblarán la membrana, dificultando la enumeración de la migración. La segunda consideración es el tamaño del poro del inserto. Debe elegirse cuidadosamente en función del tipo de célula. Si el tamaño del poro es demasiado pequeño, las células no podrán pasar a través de él.
Alternativamente, si el tamaño del poro es demasiado grande, las células simplemente caerán a través de él, lo que no es migración. Por último, hay que tener en cuenta la concentración de quimioatrayente y el tiempo de incubación que se debe permitir para la migración, ya que son interdependientes. Una concentración óptima con un tiempo de incubación adecuado, durante el cual se mantiene el gradiente de concentración entre los compartimentos, induce la migración celular debido a la quimioatracción. Por el contrario, las incubaciones prolongadas pueden ir acompañadas de un equilibrio del quimioatrayente en toda la cámara que conduce a la pérdida del gradiente químico, lo que puede confundir el análisis de los resultados obtenidos.
Con estas consideraciones en mente, vamos a discutir un protocolo utilizado para medir la migración de las células adherentes.
Las células que se van a ensayar se preparan en un medio libre de proteasas, ya que las proteasas pueden desnaturalizar importantes receptores de membrana y, en última instancia, afectar a la migración. Una vez preparadas las células, la suspensión debe diluirse hasta alcanzar una densidad de siembra óptima. Para preparar la cámara, se colocan los transwells en los pocillos de una placa multipocillos. La suspensión celular debe pipetearse en el transwell sin tocar la membrana ni introducir burbujas de aire.
Se pipetea la solución quimioatrayente en el depósito inferior, asegurándose de que la solución toque la membrana del inserto. El tiempo de incubación para la migración dependerá de las consideraciones experimentales. Tras la incubación, las membranas se fijan sumergiendo el inserto en etanol al 70%. Después de dejar secar el inserto, se añade la solución de tinción celular.
A continuación, se incuban las células durante aproximadamente 30 minutos a temperatura ambiente. Tras la incubación, los insertos se lavan con la ayuda del tampón de lavado. Por último, se puede extraer la membrana y colocarla en un portaobjetos. Las células que aparecen en la parte inferior de la membrana representan el número de células que han migrado en presencia y en ausencia de quimioatrayentes.
Dado que ya se conoce el protocolo, echemos un breve vistazo a cómo los investigadores utilizan este método en sus exploraciones.
Una de las aplicaciones más comunes de este ensayo es evaluar las propiedades quimioatrayentes de compuestos desconocidos. En este caso, los científicos estaban interesados en examinar las trayectorias de natación de los espermatozoides de las ranas en presencia de la alurina, que es una sustancia segregada por los huevos de los anfibios. Para ello, primero pipetearon espermatozoides de rana activos en la parte superior de los insertos transwell. En la parte inferior, añadieron alurina. Después de dejar que las células migraran, contaron los espermatozoides en la solución del depósito bajo el microscopio. Gracias a esta técnica, pudieron generar una curva de concentración-respuesta que mostraba el efecto de la concentración de alurina en la migración de los espermatozoides.
Cuando una célula es atacada por patógenos, envía quimioatrayentes para reclutar células inmunitarias que migran, se adhieren y posteriormente resuelven la infección. Para comprobar este fenómeno, estos científicos cultivaron células epiteliales en la parte inferior de los insertos. Posteriormente, infectaron estas células con diferentes cepas de bacterias. Por último, introdujeron células inmunitarias en la cámara superior. Se sabe que las células infectadas producen varios quimioatrayentes que inducen la migración de las células inmunitarias. Los resultados de este experimento demostraron diferentes grados de migración de neutrófilos en respuesta a diferentes tipos de infección bacteriana.
Por último, la invasión y metástasis de las células cancerosas a través de la matriz extracelular siempre ha intrigado a los biólogos celulares. En este caso, los científicos querían determinar cómo los quimioatrayentes específicos pueden contribuir a dicha migración a través de una matriz 3D. Para ello, diseñaron genéticamente dos grupos separados de células: uno que expresaba la proteína verde fluorescente y otro la roja fluorescente. A continuación, pipetearon un imitador de la matriz extracelular en la parte superior de los transwell.
Una vez solidificado, invirtieron el transwell y sembraron dos grupos de células en la parte inferior de la membrana. A continuación, volvieron a colocar el inserto en la placa de múltiples pocillos y pipetearon la solución quimioatrayente en la cámara superior. Esto hizo que las células de la parte inferior se movieran hacia arriba y a través de la matriz 3D. Con la ayuda de imágenes confocales, estos investigadores reconstruyeron la migración celular en 3D y distinguieron los patrones de migración de dos grupos de células.
Acabas de ver el vídeo de JoVE sobre el ensayo de migración transwell. Con la comprensión de los componentes y el protocolo de este método, ahora sabe por qué es tan ampliamente utilizado por los biólogos celulares. A pesar de la simplicidad de este montaje, la gama de configuraciones que este método puede adaptar lo hace indispensable para los estudios de motilidad celular. Como siempre, ¡gracias por mirar!