APL ofrece servicios de análisis en gel nativo desde 1998. Hoy en día, muchos laboratorios lamentablemente ignoran esta valiosa herramienta porque piensan que los geles nativos son demasiado difíciles de usar, o porque creen erróneamente que sólo se pueden utilizar con proteínas ácidas. En Alliance Protein Laboratories realizamos rutinariamente geles nativos tanto con proteínas básicas como ácidas. Estaremos encantados de realizar muestras para usted y/o trabajar con usted para desarrollar un protocolo para su uso en su laboratorio.
¿Qué es un gel nativo?
La electroforesis en gel «nativo» o «no desnaturalizante» se realiza en ausencia de SDS. Mientras que en la SDS-PAGE la movilidad electroforética de las proteínas depende principalmente de su masa molecular, en la PAGE nativa la movilidad depende tanto de la carga de la proteína como de su tamaño hidrodinámico.
La carga eléctrica que impulsa la electroforesis se rige por la carga intrínseca de la proteína en el pH del tampón de funcionamiento. Esta carga dependerá, por supuesto, de la composición de aminoácidos de la proteína, así como de las modificaciones postraduccionales, como la adición de ácidos siálicos.
Dado que la proteína conserva su conformación plegada, su tamaño hidrodinámico y su movilidad en el gel también variarán con la naturaleza de esta conformación (mayor movilidad para conformaciones más compactas, menor para estructuras más grandes como los oligómeros). Si la PAGE nativa se lleva a cabo cerca del pH neutro para evitar la desnaturalización ácida o alcalina, puede utilizarse para estudiar la conformación, la autoasociación o la agregación, y la unión de otras proteínas o compuestos.
Por lo tanto, los geles nativos pueden ser sensibles a cualquier proceso que altere la carga o la conformación de una proteína. Esto los convierte en herramientas excelentes para detectar cosas como:
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cambios de carga debidos a la degradación química (por ejemplo desamidación)
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desplegados, «glóbulos fundidos» u otras conformaciones modificadas
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oligómeros y agregados (tanto covalentes como no covalentes)
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eventos de unión (proteína-proteína o proteína-ligando)
Estas propiedades, y su relativamente alto rendimiento, hacen que los geles nativos sean herramientas excelentes para analizar muestras de estabilidad acelerada, demostrar la comparabilidad de diferentes lotes o procesos, o examinar los efectos de los excipientes.
Otra ventaja de los geles nativos es que es posible recuperar las proteínas en su estado nativo después de la separación. Sin embargo, la recuperación de los materiales biológicos activos puede ser necesaria antes de cualquier fijación o tinción.
Nótese que los geles nativos que se discuten aquí se denominan a veces geles «nativos claros». Se diferencian en principio de los llamados geles «nativos azules», que dependen de la unión del colorante para dar a la proteína una carga eléctrica muy alta, que supera la carga intrínseca del polipéptido. Si se supone que la cantidad de colorante unido es proporcional a la masa de la proteína, la movilidad observada mediante este protocolo «nativo azul» puede utilizarse para estimar la masa molar mediante la comparación con estándares de proteínas, de forma similar a como se hace con el SDS-PAGE. Los estándares de masa que se venden para su uso con los geles nativos azules no pueden utilizarse para estimar las masas molares de los verdaderos geles nativos que se discuten aquí.