Expresión y purificación de GyrB y GyrA
La secuencia que codifica la GyrA de longitud completa de E. coli (2-875) se insertó en un pET28b modificado que contenía una etiqueta N-terminal 10-His y una etiqueta C-terminal Twin-strep. La sobreexpresión se realizó en E. coli BL21 (DE3) pRARE2 en medio LB con 50 µg/mL de kanamicina y 35 µg/mL de cloranfenicol. Las células se indujeron con 0,35 mM de IPTG tras alcanzar una DO600 de 0,85 y la proteína se expresó a 37 °C durante 4 h. Las células se cosecharon y se resuspendieron en tampón de lisis (20 mM de Hepes, 500 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, 10% v/v de glicerol, pH 8,0) y se lisaron con tres ciclos de disrupción a alta presión utilizando EmulsiFlex-C3 a 1500 bares. La proteína GyrA se purificó mediante cromatografía de afinidad con níquel en una columna XK 26/20 empaquetada manualmente (Pharmacia) con resina Chelating Sepharose 6 Fast Flow (GE Healthcare) unida a iones Ni2+. La elución se llevó a cabo con el tampón de lisis que contenía 250 mM de imidazol pH 8,0 y las proteínas eluidas se fijaron directamente en una sefarosa de estreptavidina (GE Healthcare) de 10 ml. Las proteínas se lavaron ampliamente con el tampón Strep (20 mM de Hepes, 60 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 10% v/v de glicerol, pH 8,0) y se eluyeron con el tampón Strep que contenía 3 mM de destiobitina (Sigma-Aldrich). Tanto la etiqueta 10-His como la etiqueta Twin-strep se escindieron posteriormente mediante la proteasa PreScission (P3C) y la escisión del virus del tabaco (TEV) (relación de masas 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) durante la noche a 4 °C. A continuación, GyrA se purificó mediante una etapa de cromatografía de intercambio aniónico utilizando una columna HiTrap Q HP (GE Healthcare). La proteína se eluyó con un gradiente lineal de 20 volúmenes de columna con tampón B (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v de glicerol, pH 8,0). Las fracciones que contenían GyrA se agruparon y se cargaron en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) utilizando 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% v/v de glicerol, pH 8,0. Se obtuvieron 37 mg de GyrA a partir de 3 L de cultivos. La secuencia codificadora de GyrB (2-804) se insertó en el mismo pET28b modificado. La sobreexpresión se realizó en E. coli BL21 (DE3) pRARE2 en medio LB con 50 µg/mL de kanamicina y 35 µg/mL de cloranfenicol. Las células se indujeron con 0,35 mM de IPTG tras alcanzar una DO600 de 0,85 y la proteína se expresó a 18 °C durante 18 h. El procedimiento de purificación de GyrB es el descrito anteriormente para GyrA. Se obtuvieron 10 mg de GyrB a partir de 3 L de cultivos.
Reconstitución completa de la ADN girasa
E. coli GyrA y GyrB se mezclaron en proporción equimolar para permitir la reconstitución completa de la ADN girasa. El complejo se purificó además en una columna de cromatografía de exclusión de tamaño Superdex S200 16/60 (GE Healthcare) utilizando un tampón crio-EM (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (Fig. 1 y Fig. Suplementaria. 1).
Preparación del ácido nucleico
Se reconstituyó un dúplex de ADN de 180 pb con dos oligonucleótidos sintéticos asimétricos fosforilados12 obtenidos de Sigma-Aldrich (Tabla Suplementaria 1). Brevemente, los ácidos nucleicos se disolvieron en agua libre de DNAse a una concentración de 1 mM. Para ensamblar el ADN de doble cadena, cada oligo se mezcló en una proporción molar de 1:1, y se recoció incubando a 95 °C durante 2 min y luego disminuyendo la temperatura en 1 °C cada 1 min hasta alcanzar los 20 °C. El dúplex de ADN doblemente mellado recocido se cambió en tampón en Hepes 20 mM pH 8.0 con una columna BioSpin 6 (BioRad).
Formación de complejos para crio-EM
La ADN girasa purificada se mezcló con el dsDNA de 180 pb en proporción molar con una concentración final de proteína y ADN de 32 µM. La mezcla se incubó durante 10 min a 37 °C. Se añadió gepotidacina (GSK2140944, adquirida en MedChemExpress) resuspendida a 10 mM en DMSO al 100% para alcanzar una concentración final de 170 µM (1,7% DMSO). La mezcla se incubó durante 10 minutos a 37 °C. Se añadió al complejo AMP-PNP (Sigma) a una concentración final de 340 µM. El complejo totalmente reconstituido se incubó de nuevo 30 min a 30 °C. Por último, se añadió al complejo 8 mM de CHAPSO (Sigma-Aldrich). La muestra se centrifugó 2 h a 16.000 × g para eliminar posibles agregados.
Preparación de la rejilla de crio-EM
Las rejillas de cobre de malla 300 de Quantifoil R-1.2/1.3 se cargaron por incandescencia durante 20 s antes de la aplicación de 4 µl del complejo. Tras 30 s de incubación, las rejillas se congelaron por inmersión en etano líquido utilizando un Vitrobot mark IV (FEI) con una humedad de cámara del 95% a 10 °C.
Microscopía electrónica
Las imágenes de EFTEM se realizaron en un microscopio Titan Krios operado a 300 kV (FEI) equipado con una cámara de electrones directa K2 Summit (Gatan), un filtro de energía GIF Quantum (Gatan) operado en modo de pérdida de energía cero con un ancho de rendija de 20 e-V, una placa de fase Volta (FEI) y un corrector CS (FEI). Las imágenes se registraron en el modo de nanosonda EFTEM con Serial EM53 en el modo de recuento de superresolución a un aumento nominal de 130.000x con un tamaño de píxel de superresolución de 0,44 Å y un objetivo de desenfoque constante de -500 nm (Supplementary Fig. 2c). El VPP se avanzó a una nueva posición cada 100 minutos (Fig. 2b suplementaria). Se recogieron cuatro conjuntos de datos con una tasa de dosis de 6 a 8 e-/píxel/s (0,88 Å de tamaño de píxel en la muestra) en el detector. Las imágenes se grabaron con una dosis total de 50 e-/Å2, un tiempo de exposición entre 7 y 10 s y subfotogramas de 0,2 a 0,25 s (35 a 50 fotogramas totales). Se grabaron un total de 11.833 películas tras la recogida de datos de los 4 conjuntos de datos.
Procesamiento de datos
El procesamiento de datos de cada conjunto de datos se realizó por separado siguiendo el mismo procedimiento hasta los refinamientos 3D cuando se fusionaron las partículas. Los subfotogramas de superresolución fraccionados por dosis se corrigieron en ganancia con IMOD54 y se dividieron en dos partes mediante un recorte de Fourier, se corrigieron en deriva y se ponderaron en dosis con MotionCor255, obteniéndose imágenes sumadas con un tamaño de píxel de 0,88 Å. La función de transferencia de contraste de las micrografías corregidas se estimó utilizando GCTF v1.0656. Los anillos de Thon se inspeccionaron manualmente en busca de astigmatismo y se descartaron las micrografías con resoluciones medidas inferiores a 4 Å, obteniéndose las 8.701 micrografías restantes. Las partículas se seleccionaron automáticamente mediante un protocolo de selección de manchas gaussianas sin referencia en RELION229,30. Tomando en conjunto los 4 conjuntos de datos, se seleccionaron un total de 1.572.962 partículas. Las partículas de cada conjunto de datos, divididas cuatro veces, se sometieron por separado a dos rondas de clasificación 2D en RELION2 para eliminar las partículas basura y las contaminaciones, lo que dio como resultado un total de 479.667 partículas para su posterior procesamiento. Las partículas de los cuatro conjuntos de datos se fusionaron en un único conjunto de datos, seguido de una reextracción con centrado en un formato binado de 3 × 3. A continuación, se llevó a cabo una última ronda de clasificación 2D que dio como resultado una pila de partículas final de 338.616 partículas. La pila de partículas posterior se sometió a una ronda de clasificación 3D ab-initio en cryoSPARC31. Tras descartar los modelos de baja calidad, el modelo ab-initio restante dio como resultado un conjunto de datos final de 191.456 partículas, con un umbral de probabilidad de clase de 0,9 (Fig. suplementaria 2a). El modelo ab-initio se filtró a 30 Å y se utilizó como referencia para el refinamiento homogéneo en cryoSPARC, dando como resultado un mapa de 5,4 Å. Las coordenadas de las partículas refinadas se utilizaron para la estimación local del CTF utilizando GCTF v1.06, seguida de la reextracción de partículas binadas 2 × 2 con centrado. Esta nueva pila de partículas fue sometida a un auto-refinamiento 3D en RELION2 utilizando el modelo ab-initio filtrado a 30 Å, obteniendo un mapa con una resolución global de 5,0 Å (Fig. 3 suplementaria). La resolución local mostró un rango de resolución de 4,0 Å en el núcleo de unión/declaración del ADN a 9,0 Å en el dominio ATPasa y en la rueda β de GyrA que envuelve el ADN, lo que indica una alta flexibilidad de estos dos módulos. Para obtener una reconstrucción final del complejo completo con densidades bien definidas para cada dominio, realizamos una clasificación 3D sin alineación que produjo varias clases diferentes. Se fusionaron las partículas de tres clases (94.633 partículas). La subsiguiente pila de partículas de 1×1 se refinó en RELION2 sin máscara hasta las últimas iteraciones de refinamiento en las que se aplicó una máscara suave para mejorar la resolución. El posprocesamiento del mapa dio lugar a una reconstrucción del complejo global con una resolución de 6,6 Å (Fig. Suplementaria 3).
Se utilizó una combinación de diferentes enfoques locales para identificar diferentes conformaciones y mejorar la resolución local de cada dominio. Dado que el dominio ATPasa era demasiado pequeño para un refinamiento enfocado en 3D, primero realizamos una clasificación enfocada en 3D del dominio ATPasa con una máscara suave y sin alineación en RELION2. Se seleccionó una clase de 58.329 partículas con una densidad bien definida del dominio de la ATPasa, seguida de una reextracción de partículas de 1 × 1-binned, lo que produjo partículas con un tamaño de píxel de 0,88 Å/píxel. Para facilitar una alineación precisa de las partículas, esta clase se refinó aún más en RELION2 utilizando una máscara suave alrededor del dominio ATPasa y el dominio de unión/destrucción del ADN, obteniendo un mapa de resolución global de 5,9 Å (ATPasa-Core) (Fig. Suplementaria 3).
En segundo lugar, realizamos una clasificación en 3D enfocada de la rueda β de GyrA con una máscara suave y sin alineación en RELION2. Se seleccionó una clase de 45.040 partículas con una densidad bien definida de la rueda β de GyrA, seguida de una reextracción de partículas de 1 × 1-binned, lo que produjo partículas con un tamaño de píxel de 0,88 Å/píxel. Esta clase se refinó aún más en RELION2 utilizando una máscara suave alrededor de la β-rueda de espigas y el dominio de unión/borrado del ADN, obteniendo un mapa de resolución de 6,3 Å (CTD-Core).
Por último, se realizó un auto-refinamiento 3D enfocado en RELION2 utilizando una máscara suave alrededor del dominio de unión/borrado del ADN. El posprocesamiento del mapa produjo una reconstrucción de 4,3 Å de resolución del dominio de unión/cicatrización del ADN. A continuación, se llevó a cabo una clasificación 3D enfocada del dominio de unión/cicatrización del ADN. Dos de las clases mostraron mejores precisiones angulares y distintas conformaciones cerradas (60.548 partículas) y pre-abiertas (53.655 partículas) del dominio de unión/lavado del ADN. Estas dos clases se refinaron aún más en RELION2 mediante un refinamiento 3D enfocado con una simetría C2 utilizando partículas binadas 1 × 1 y dieron reconstrucciones con una resolución global de 4,0 y 4,6 Å después del post-procesamiento, respectivamente (Fig. Suplementaria 3). El dominio cerrado de unión/división del ADN se refinó aún más mediante un refinamiento 3D focalizado utilizando una máscara blanda, que excluye la inserción desordenada de TOPRIM, dando lugar a un mapa de 4,0 Å de alta calidad (Supplementary Fig. 3).
Todas las resoluciones reportadas se basan en el criterio estándar de oro FSC-0.14357 y las curvas FSC fueron corregidas por los efectos de convolución de una máscara suave utilizando la sustitución de ruido de alta resolución58 en RELION2 así como en cryoSPARC (Supplementary Fig. 4a). Todas las reconstrucciones se agudizaron aplicando un factor B negativo que se estimó mediante procedimientos automatizados59. La resolución local de los mapas se calculó utilizando Blocres60 (Supplementary Fig. 4c). Los mapas de crio-EM del complejo global, del núcleo de la ATPasa, del núcleo de la CTD y del dominio de unión/división del ADN en estado cerrado (con y sin inserción de TOPRIM) y en estado de preapertura se han depositado en el EM Data Bank con los números de acceso EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912, respectivamente.
Construcción y refinamiento del modelo
La reconstrucción EM del dominio de unión/división del ADN que carece de la inserción TOPRIM resuelta a 4,0 Å fue de la mejor calidad. Se podían ver casi todas las cadenas laterales y la densidad de la Gepotidacina era claramente visible. Este mapa se utilizó para refinar una estructura cristalina del dominio de unión/borrado de ADN de la ADN girasa de E. coli17. Se generó un modelo atómico dimérico del dominio de unión/borrado de ADN utilizando el PDB 3NUH en PyMol (Schrodinger L.L.C.). El modelo atómico posterior fue despojado de los aminoácidos pertenecientes a la inserción TOPRIM, de todos los iones y de las moléculas de agua, con todas las ocupaciones fijadas en 1 y los factores B fijados en 50. En primer lugar, el modelo atómico fue ajustado con cuerpo rígido en el mapa filtrado y afilado con Chimera61. Se realizó una primera ronda de refinamiento del espacio real en PHENIX62 utilizando un ajuste local del espacio real y un refinamiento de minimización global impulsado por el gradiente. A continuación, se copiaron 20 ácidos nucleicos de la estructura de la ADN girasa de S. aureus41 (PDB 5IWM) y se ajustaron a nuestro modelo atómico. La secuencia del ADN se modificó de acuerdo con el ADN utilizado en nuestra estructura. Los residuos de proteína y ácidos nucleicos que faltaban se construyeron manualmente en COOT63. El modelo atómico y el diccionario de restricciones de la gepotidacina (GSK-2140944) se generaron con el servidor Grade (http://grade.globalphasing.org). La gepotidacina se ajustó manualmente en la densidad electrónica vacía en COOT y luego se duplicó. Ambos duplicados se ajustaron a una ocupación de 0,5. Se realizaron varias rondas de refinamiento en espacio real en PHENIX utilizando restricciones para la estructura secundaria, rotámeros, Ramachandran y simetría no cristalográfica, siempre seguidas de una inspección manual en COOT, hasta que se obtuvo un modelo convergente. Finalmente, los factores B se refinaron mediante una ronda final de refinamiento en espacio real en PHENIX utilizando los mismos ajustes que antes. Una vez que el refinamiento ha convergido, las coordenadas atómicas de la inserción TOPRIM se añadieron al modelo atómico. Se refinó aún más en las reconstrucciones EM que contienen la densidad de la inserción en estados cerrados y pre-abiertos utilizando el mismo procedimiento. Se realizó una validación cruzada de medio mapa para definir 1,5 como el mejor peso de refinamiento en PHENIX, permitiendo la reducción del choque de átomos y la prevención del sobreajuste del modelo (Supplementary Fig. 4e). Todos los pasos de refinamiento se realizaron utilizando el límite de resolución de las reconstrucciones según el criterio estándar de oro FSC-0.14357. Los parámetros de refinamiento, las estadísticas del modelo y las puntuaciones de validación se resumen en la Tabla Suplementaria 2. Los modelos atómicos del dominio de unión/declaración del ADN de E. coli en conformaciones cerradas (con y sin inserción) y de preapertura se han depositado en el Protein Data Bank con los números de acceso 6RKU, 6RKS, 6RKV, respectivamente.
Para el complejo global, utilizamos una combinación de diferentes reconstrucciones EM para construir el modelo atómico del complejo global de la ADN girasa. La estructura de la ATPasa-Core resuelta a 5,9 Å se utilizó para el ajuste de cuerpo rígido en Chimera de la estructura cristalina del dominio de la ATPasa en complejo con ADPNP32 (PDB 1EI1) y el dominio de unión/división del ADN refinado en conformación cerrada. La calidad de la densidad electrónica permitió construir en COOT los residuos que faltaban en el enlace entre el dominio ATPasa y el dominio de unión/decaptación de ADN. La estructura del CTD-Core resuelta a 6,3 Å se utilizó para ajustar con precisión el cuerpo rígido de la estructura cristalina del β-pinwheel10 en Chimera. Los 10 aminoácidos que faltaban (564-574) tras la caja GyrA se añadieron utilizando el servidor de modelado Phyre264. La calidad de la densidad electrónica permitió construir en COOT los ácidos nucleicos que faltaban alrededor de la β-rueda de espigas, así como los 10 aminoácidos que enlazan los últimos residuos de GyrA con la β-rueda de espigas. Basándose en una predicción de estructura secundaria, una parte del enlazador se construyó como una hélice alfa (Fig. 3). El modelo atómico subsiguiente que contenía el dominio ATPasa, el dominio de unión/división del ADN y una rueda β-pin se ajustó con cuerpo rígido a la estructura global del complejo resuelta a 6,6 Å utilizando Chimera. A continuación, se ajustó una copia de la primera rueda beta en la densidad de la segunda rueda beta en COOT. Los ácidos nucleicos que faltaban alrededor de la segunda rueda beta, así como los 10 residuos que faltaban en el enlazador, se construyeron manualmente en COOT. El modelo atómico resultante fue despojado de todos los iones y moléculas de agua, con todas las ocupaciones fijadas en 1 y los factores B fijados en 50. Por último, el refinamiento en espacio real del modelo atómico con respecto a la estructura global del complejo se llevó a cabo en PHENIX utilizando el refinamiento de cuerpo rígido y el refinamiento de minimización global impulsado por el gradiente. El límite de resolución para el refinamiento se fijó de acuerdo con el criterio estándar de oro FSC-0.14357. También se realizaron validaciones cruzadas de medio mapa (Supplementary Fig. 4e). Los parámetros de refinamiento, las estadísticas del modelo y las puntuaciones de validación se resumen en la Tabla Suplementaria 2. El modelo atómico de la estructura global se ha depositado en el Protein Data Bank con el número de acceso 6RKW. Todas las figuras se crearon con Chimera61, ChimeraX65 y PyMol (Schrodinger L.L.C.).
Purificación de E. coli GyrB R286K, R286Q y E264A
El pET28b modificado utilizado para la sobreexpresión de E. coli GyrB se mutó mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange XL (Agilent) para generar tres plásmidos que albergan las mutaciones R286K, R286Q o E264A (Tabla suplementaria 4). Los procedimientos de sobreexpresión y purificación de los tres mutantes son idénticos a los de la GyrB de tipo salvaje descritos anteriormente en la sección de Métodos.
Purificación de la GyrB K284R, K284Q de T. thermophilus
El pET28b modificado utilizado para la GyrB de tipo salvaje de T. thermophilus GyrB de tipo salvaje12 se mutó mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange XL (Agilent) para generar dos plásmidos que albergan las mutaciones K284R o K284Q (Tabla suplementaria 4). Los procedimientos de sobreexpresión y purificación de los dos mutantes son idénticos a los de la GyrB de tipo salvaje de E. coli descritos anteriormente en la sección Métodos.
Ensayo de superenrollamiento de ADN
Una concentración creciente de ADN girasa (GyrA2B2) se incubó a 37 °C con 6 nM de plásmido pUC19 relajado en una mezcla de reacción que contenía 20 mM de Tris-acetato de pH 7,9, 100 mM de acetato de potasio, 10 mM de acetato de magnesio, 1 mM de DTT, 1 mM de ATP, 100 µg/ml de BSA. Tras 30 minutos, las reacciones se detuvieron mediante la adición de SDS al 1%. Se utilizó la electroforesis en gel de agarosa para controlar la conversión de la pUC19 relajada a la forma superenrollada. Las muestras se corrieron en un gel de agarosa al 0,8%, tampón Tris Borato EDTA (TBE) 1X, a 6 V/cm durante 180 min a temperatura ambiente. Los geles de agarosa se tiñeron con 0,5 mg/ml de bromuro de etidio en TBE 1X durante 15 minutos, seguidos de 5 minutos de desentumecimiento en agua. Los topoisómeros de ADN se revelaron utilizando un Typhoon (GE Healthcare).
Asunto de actividad de la ATPasa
La hidrólisis del ATP se mide siguiendo la oxidación del NADH mediada por la piruvato quinasa (PK) y la lactato deshidrogenasa (LDH). La absorbancia se monitorizó a 340 nm durante 600 s a 37 °C con un espectrofotómetro Shimadzu 1700. Las reacciones se registraron por triplicado con 50-100 nM de GyrA2B2 y 16 nM de ADN lineal (pCR-blunt) en 500 µl de un tampón que contenía 50 mM de Tris HCl pH 7,5, 150 mM de acetato de potasio, 8 mM de acetato de magnesio, 7 mM de BME, 100 µg/mg de BSA, 4U/5U de mezcla de PK/LDH, 2 mM de PEP y 0.2 mM de NADH.
Alineamiento múltiple y conservación evolutiva de residuos
Secuencias de la proteína ATPasa/Transductora GyrB de 30 especies (códigos Uniprot: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa; Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) se alinearon utilizando el servidor Clustal Omega (EMBL-EBI). El alineamiento posterior se utilizó para trazar la conservación evolutiva de los aminoácidos en la estructura de la ATPasa/transductor (PDB ID 1EI1) utilizando el servidor ConSurf (http://consurf.tau.ac.il). El árbol filogenético se generó mediante el método de unión de vecinos utilizando el alineamiento múltiple en Clustal Omega.
Resumen del informe
Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el resumen del informe de Nature Research vinculado a este artículo.