Sujetos
En este estudio participaron 88 pacientes con LC sin tratamiento y sin metástasis a distancia. Todos los pacientes fueron diagnosticados con carcinoma de células escamosas de la laringe por el examen patológico de las muestras y fueron tratados en el Departamento de Otorrinolaringología, Cirugía de Cabeza y Cuello de la Universidad de Ryukyus, entre enero de 2008 y diciembre de 2017. El pronóstico final de los pacientes se juzgó en julio de 2018. La clasificación del estadio del tumor, los ganglios y las metástasis (TNM) se llevó a cabo de acuerdo con el Manual de Estadificación de la AJCC (7ª edición). Para determinar el estadio clínico y detectar cánceres primarios múltiples concomitantes, los pacientes se sometieron a exámenes físicos y endoscópicos del tracto gastrointestinal superior, inspección ultrasónica del cuello, tomografía computarizada (TC) y tomografía por emisión de positrones con 18F.
Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Ryukyus y se llevó a cabo de acuerdo con la Declaración de Helsinki de 1975, revisada en 2008. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes con LC antes de la inscripción.
Tratamiento
El tratamiento principal para la lesión primaria con intención curativa fue la radioterapia (RT) convencional sola o la resección con láser en T1, la quimiorradioterapia concurrente (CCRT) en T2, la CCRT o la cirugía en T3, y la cirugía en T4, independientemente de la presencia de VPH. Las lesiones ganglionares se trataron con quimioterapia o disección del cuello combinada con la resección de la lesión primaria. A todos los pacientes que recibieron RT (dosis total, 70 Gy) se les planificó la radioterapia tridimensional asistida por TC en la posición de tratamiento con inmovilización por máscara. El protocolo para la RTCC fue el que se informó anteriormente. Cuando el tumor primario en T3 no mostró una respuesta parcial independientemente de la respuesta de los ganglios linfáticos del cuello con una irradiación de 39,6 Gy, los pacientes fueron sometidos a una cirugía curativa de la lesión primaria combinada con la disección del cuello.
Detección del estado del VPH e inmunohistoquímica de p16
Todas las muestras de tejido de las lesiones primarias sin radiación ni quimioterapia se analizaron con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la detección del ADN del VPH utilizando muestras frescas congeladas, que se obtuvieron en la biopsia o en la resección quirúrgica, e inmunohistoquímica de p16 utilizando muestras FFPE. Los casos con resultados negativos de detección del VPH en la PCR y sobreexpresión de p16 (≥75% de células positivas y una intensidad de tinción al menos moderada) se evaluaron además para determinar el estado del VPH mediante hibridación in situ (ISH) con sondas de ADN del VPH (DNA ISH) . La PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) para la carga viral y el estado físico, como se describe a continuación, se llevó a cabo en los casos que albergaban el VPH-16.
PCR para la detección del ADN del VPH
En resumen, el ADN se aisló de las muestras tumorales utilizando un kit Gentra Puregene Tissue (QIAGEN, Germantown, MD). La presencia e integridad del ADN se verificó en todas las muestras mediante la amplificación del gen de la β-globina por PCR utilizando los cebadores PC04 y GH20. Los conjuntos de cebadores de consenso general GP5+/GP6+ y MY09/MY11 se utilizaron para analizar la presencia de ADN del VPH mediante PCR (Tabla 1), tal como se ha descrito anteriormente. Además, las muestras de ADN negativas para la PCR de GP5+/GP6+ o MY09/MY11 se volvieron a amplificar mediante un enfoque de PCR anidada con el par de cebadores GP5+/GP6+. Los productos de la PCR del tamaño esperado (GP5+/GP6+, 150 pb; MY09/MY11, 450 pb) se purificaron y secuenciaron directamente con un analizador genético ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las secuencias se alinearon y compararon mediante el programa BLAST con las de los tipos de VPH conocidos en la base de datos GenBank.
Inmunohistoquímica de p16
La inmunohistoquímica de p16 se llevó a cabo utilizando un kit de histología CINTec® p16 (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Alemania) según el protocolo del fabricante. La inmunomarcación se visualizó mediante la incubación en 3,3′-diaminobencidina y los portaobjetos teñidos se contratinaron con hematoxilina.
Los criterios de puntuación de la inmunorreactividad de p16 utilizados en el presente estudio fueron los siguientes: 0, sin tinción; 1, 1 – < 25% de las células tumorales positivas para p16; 2, 25 – < 50% positivo; 3, 50 – < 75% positivo; 4, ≥75% positivo y débil intensidad de tinción; y 5, ≥75% positivo y al menos moderada intensidad de tinción. El término «sobreexpresión de p16» (p16-positivo) se definió como una puntuación de 5 en el presente estudio.
ISH con sondas de ADN del VPH
La ISH basada en biotinil tiramida se llevó a cabo utilizando la sonda de ADN biotinilada GenPoint™ HPV y el sistema de amplificación de señal de tiramida GenPoint para sondas biotiniladas de acuerdo con el protocolo del fabricante (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). La sonda de ADN biotinilado GenPoint HPV reacciona con los tipos de VPH 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68 en secciones de 4μm de grosor de muestras FFPE. La detección de la sonda hibridada se llevó a cabo utilizando el sistema de detección GenPoint de acuerdo con el protocolo del fabricante, con el primario de estreptavidina-peroxidasa de rábano (HRP), tiramida de biotinilo, secundario de estreptavidina-HRP y 3,3′-diaminobenzidina l (Dako; Agilent Technologies). Los portaobjetos se contrateñaron con hematoxilina.
Estimación de la carga viral y el estado físico del VPH-16 mediante qPCR
Para evaluar la carga viral y el estado físico del VPH-16, se realizó la qPCR como se ha descrito previamente. Brevemente, se utilizaron cebadores y sondas TaqMan dirigidos a los marcos de lectura abiertos del VPH-16 E2 y E6 (Tabla 1). Los cebadores y las sondas reconocen la región bisagra del E2, que se elimina en la integración del VPH-16. Se crearon dos curvas estándar para los genes E2 y E6 mediante la amplificación de diluciones seriadas de 10 veces (101, 102, 103, 104, 105 y 106 copias virales) del plásmido pB-actin early, que fue un regalo de Karl Munger, que lleva la región completa del gen temprano del VPH-16 (plásmido Addgene # 13711; Addgene, Cambridge, MA). La carga de ADN viral se evaluó calculando el número de copias de E6. Se creó una curva estándar externa utilizando diluciones seriadas conocidas (0,3, 3, 30 y 300 ng) de ADN genómico placentario humano (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) para la cuantificación del ADN celular, y la β-globina se amplificó como se ha descrito anteriormente. La cantidad de ADN se calculó trazando los valores Cq contra el logaritmo de la curva estándar. El estado físico del VPH-16 se evaluó basándose en un método previamente publicado. Una relación E2/E6 ≥ 1 indica el predominio de la forma episomal, mientras que una relación número de copias E2/total E6 < 1 indica la presencia de formas tanto integradas como episomales (forma mixta).
Detección de la expresión de ARNm de E6 mediante qPCR y RNA ISH en pacientes positivos al VPH-16 con sobreexpresión de p16
Se detectó la expresión de ARNm de E6 en muestras de pacientes identificados como positivos al VPH-16 con sobreexpresión de p16. El ARN total se extrajo de tejidos congelados utilizando RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japón) según las instrucciones del fabricante. El ARN total (500 ng) se utilizó para sintetizar el ADNc de la primera cadena utilizando un kit de reactivos PrimeScript™ RT con gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para medir la expresión del ARNm del VPH-16 E6, se realizó la qPCR utilizando el sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch™ (Bio-Rad, Hércules, CA) y la mezcla maestra de PCR TaqMan II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Se utilizaron cebadores y sondas TaqMan (Tabla 1) dirigidos al gen E6 del VPH-16 y al gen de la β-actina. La sonda de β-actina se marcó con FAM en el extremo 5′ y con TAMRA en el extremo 3′ (Applied Biosystems Japan, Tokio, Japón). Las condiciones de amplificación fueron: 2 min a 50 °C, 10 min a 95 °C y un ciclo de 2 pasos de 95 °C durante 15 s y 60 °C durante 60 s para un total de 40 ciclos. Se generaron dos curvas estándar para los genes E6 y β-actina mediante la amplificación de diluciones seriadas de 10 copias (101, 102, 103, 104, 105 y 106) del plásmido pB-actina temprana y del plásmido pCAG-mGFP-actina, que fue un regalo de Ryohei Yasuda, que lleva la región codificante completa de β-actina (plásmido Addgene # 21948; Addgene). La expresión del gen E6 en cada muestra se normalizó por la cantidad del control interno β-actina.
La ISH del ARNm del VPH-16/- 18 E6/E7 se realizó utilizando un kit de reactivos RNAscope® 2.5 HD (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, las secciones seriadas de 4μm de espesor de las muestras FFPE se desparafinaron en xileno y se rehidrataron utilizando una serie de alcohol graduado. La peroxidasa endógena se bloqueó con el reactivo de peróxido de hidrógeno RNAscope® a temperatura ambiente durante 10 minutos. La recuperación del ARN del VPH objetivo se realizó en el reactivo de recuperación de objetivos RNAscope® a 100 °C durante 15 minutos. Los portaobjetos se digirieron con RNAscope® Protease Plus a 40 °C durante 30 min. La sonda de ARN HPV-16/- 18 E6/E7 (RNAscope® Probe-HPV16/18) se añadió a las secciones y se aplicó un cubreobjetos. Los portaobjetos se transfirieron a una cámara humidificada para la hibridación a 40 °C durante 2 h. A continuación, se retiraron los cubreobjetos y se lavaron los portaobjetos con RNAscope® Wash Buffer Reagent a 40 °C. La amplificación de la señal se realizó según las instrucciones del fabricante. La detección de la sonda hibridada se realizó con 3,3′-diaminobenzidina (kit de reactivos RNAscope® 2.5 HD). Los portaobjetos se contrateñaron con hematoxilina. Los portaobjetos de control positivo (células HeLa que expresan el ARNm del VPH-18 E6/E7) se incluyeron en la ISH del ARN. La tinción positiva se identificó como puntos marrones observados en el núcleo y/o el citoplasma.
Análisis estadístico
Se utilizó la prueba de chi-cuadrado de Pearson para comparar las características de las pacientes con LC según el ADN del VPH y el estado de sobreexpresión de p16. La supervivencia acumulada (SC) se calculó mediante el método de Kaplan-Meier y se comparó entre dos grupos mediante el test de log-rank. Todos los análisis se realizaron con el paquete estadístico SPSS (SPSS, versión 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 se consideró significativo.