La observación de que la inmunoneutralización de la somatostatina aumentó el volumen basal y la producción de amilasa en un modelo de páncreas de rata aislado, sugiere una fuente intrapancreática de somatostatina. Por lo tanto, esta somatostatina pancreática podría causar una inhibición tónica de la secreción pancreática exocrina (97). En ratas conscientes con secreciones biliares y pancreáticas devueltas al intestino, la somatostatina iv (5 µg kg-1 h-1) inhibió la secreción pancreática basal de proteínas y fluidos en un 84 y 64%, respectivamente; la adición de atropina ip (500 µg kg-1 h-1) no causó una mayor inhibición (51). En ratas anestesiadas, la secreción basal de amilasa fue significativamente inhibida por una infusión de somatostatina a una dosis relativamente alta de 100 µg 100 g-1 h-1. Sin embargo, cuando se administró una inyección en bolo de 50 µg 100 g-1 de peso corporal, la liberación de amilasa se cuadruplicó durante 20 minutos (39). En un estudio anterior (25), la somatostatina administrada en dosis de 0,4 a 25 µg kg-1 h-1 a ratas con fístula consciente dio lugar a disminuciones dependientes de la dosis en el flujo basal, la liberación de bicarbonato y de proteínas. Con las dosis más altas, la liberación de proteínas se redujo en un 80%, el bicarbonato en un 63% y el flujo en un 42%. En ratas anestesiadas con uretano, se observó un aumento inicial de todos los parámetros pancreáticos en los dos primeros minutos, seguido de una disminución del 30 al 40% de la producción de proteínas. En estas condiciones, la somatostatina tuvo que alcanzar la dosis de 100 µg kg-1 h-1 para afectar a la liberación basal de bicarbonato. Estos datos sobre la secreción pancreática basal de líquido y proteínas indican que el efecto inhibidor de la somatostatina parece ser específico de la especie y sensible a la anestesia, como se demostró anteriormente (17). Cuando se infundió a las ratas por vía intraduodenal SS-14 en dosis de 12 a 96 µg kg-1 h-1, el volumen total basal y la producción de proteínas no se vieron afectados; estos resultados podrían indicar que la somatostatina duodenal luminal no influye en la secreción pancreática basal directamente o a través de la liberación basal de CCK y secretina (126). Al contrario que en la rata, la infusión iv de SS-28 a 400 ng kg-1 h-1 inhibió totalmente la secreción basal de fluidos y proteínas en el perro consciente (147). También en perros preparados con fístulas gástricas y pancreáticas, la somatostatina-14 a 2,5 µg kg-1 h-1 inhibió la salida basal de volumen y proteínas en más del 90% (146).
En el hombre, la estimulación pancreática por administración intraduodenal de triptófano o de una mezcla de aminoácidos fue atenuada por el SS-28 exógeno (58). En otros estudios realizados en el hombre, la octreotida inhibió la secreción postprandial de enzimas pancreáticas (81). En el perro, el SS-14 administrado en bolo iv a 3,5 µg kg-1 seguido de una infusión a 3,5 µg kg-1 h-1 provocó reducciones significativas de las actividades duodenales de la tripsina y la amilasa durante la estimulación de una comida de prueba (70). En la rata, la octreotida inhibió significativamente el volumen pancreático, el bicarbonato, la amilasa y los niveles séricos de secretina y CCK en respuesta al ácido oleico intraduodenal, un liberador de CCK (137).
En voluntarios sanos (30), se obtuvo jugo pancreático puro mediante canulación endoscópica del conducto pancreático principal. En respuesta a la secretina sintética (0,06 CU kg-1 h-1), la concentración de bicarbonato en el jugo pancreático alcanzó niveles de 117 µEq ml-1 tras 10 min y un flujo de jugo de 7,3 ml/5 min tras 15 min de infusión de secretina. El SS-14 provocó una disminución del 47% del flujo pancreático después de 10 min y del 67% después de 15 min. Las concentraciones de bicarbonato y proteínas en el jugo pancreático sólo mostraron una tendencia a disminuir a la dosis de somatostatina de 5 µg kg-1 h-1. También en humanos, la secreción de enzimas pancreáticas, pero no la de bicarbonato, estimulada por la secretina (250 ng kg-1/20 min) y la caeruleína (25 ng kg-1/20 min) fue inhibida por el SMS 201-995 de forma independiente de la dosis (73). En perros conscientes (147), la secreción de líquido y bicarbonato estimulada por la secretina (1 CU kg-1 h-1) se vio ligeramente afectada por dosis mayores de SS-28 (400 ng kg-1 h-1). A la misma dosis, la producción de proteínas estimulada por la caeruleína se vio significativamente inhibida. En ratas anestesiadas, la somatostatina-14 lineal administrada a 100 µg/100 g-1 h-1 causó una fuerte inhibición de las liberaciones de amilasa y tripsina pancreáticas estimuladas por 3 unidades de perro IVY/100 g-1 h-1 de CCK, con un rápido rebote de estas secreciones una vez terminada la infusión de somatostatina (39). En ratas conscientes con desviación de jugo pancreático (51), que provocó fuertes aumentos de las secreciones de proteínas y fluidos, las cinco dosis de octreotida infundida (5,20,80,320 y 1280 ng kg-1 h-1) inhibieron significativamente la secreción de proteínas y fluidos con IC50 de 40 y 60 ng kg-1 h-1, respectivamente. La inhibición máxima de proteínas y fluidos alcanzó el 90% y el 75%, respectivamente, a la dosis de 1,28 µg kg-1 h-1. El SS-14, comparado con su análogo octreotida, tuvo una IC50 de 0,7 µg kg-1 h-1 para la secreción de proteínas y de 1,2 µg kg-1 h-1 para la secreción de fluidos, con un efecto inhibitorio máximo obtenido a 25 µg kg-1 h-1 tanto para la secreción de proteínas como de fluidos. Estos datos indican que la octreotida es 20 veces más potente que el SS-14 en la inhibición de la secreción pancreática de proteínas y volumen estimulada por la desviación del jugo pancreático.
Estudios in vitro
La secreción pancreática de enzimas y fluidos in vivo es la suma de numerosos procesos fisiológicos complejos que incluyen la interacción de hormonas endocrinas y paracrinas, así como la estimulación y liberación de neurotransmisores. Debido a estas múltiples interacciones, a menudo es difícil evaluar si un compuesto que inhibe la secreción pancreática in vivo afecta a las funciones de las células acinares y ductales directamente o altera la liberación de secretagogos. Por lo tanto, el páncreas perfundido aislado, las preparaciones de células acinares y ductales aisladas y los cultivos celulares de ambos tipos de células pueden dar respuesta a algunas de estas cuestiones.
Las células acinares pancreáticas de la rata poseen receptores específicos para la somatostatina-14 y 28 (124,166) que permanecen presentes después de las preparaciones celulares (40). También se ha informado de que en el páncreas canino aislado perfundido, la glándula puede captar hasta un 50-80% de somatostatina perfundida en un rango de concentración de 20 a 4000 pg ml-1 en comparación con menos del 21% de insulina o glucagón (71). Esta observación fue confirmada posteriormente con la extracción de SS-14 por el páncreas canino in situ con una media superior al 50% en comparación con menos del 17% para el glucagón (152). Todas estas observaciones permiten pensar que la somatostatina debería ser capaz de inhibir directamente la secreción enzimática pancreática estimulada por vía neural u hormonal in vitro utilizando las preparaciones celulares citadas anteriormente.
A pesar de los numerosos estudios realizados, el efecto inhibidor del SS-14 y del SS-28 sobre la liberación enzimática estimulada de los acinos pancreáticos aislados sigue siendo controvertido. Para entender algunos de estos resultados opuestos, puede ser útil hacer una distinción entre el efecto del SS en la estimulación donde el agonista como el VIP actúa a través del AMPc, donde el SS inhibe y agonistas como la CCK donde algunos investigadores observaron un efecto inhibitorio y otros no. En acinos de cobayo perfundidos, el perfil cinético de la liberación de amilasa en respuesta al VIP fue significativamente disminuido por el SS (100 nM) (140). Por otro lado, la octreotida (100 nM) inhibió significativamente la liberación sinérgica de amilasa estimulada por secretina + CCK-8 o por VIP + CCK-8 (65). La somatostatina también inhibió el efecto del AMPc sobre la secreción de amilasa inducida por el calcio de los acinos pancreáticos de rata desplazando la curva dosis-respuesta hacia la derecha (99), otro ejemplo de que el SS actúa a través de la vía del AMPc.
Sin embargo, muchos otros estudios demuestran claramente que la somatostatina no tiene efectos inhibidores sobre el páncreas exocrino in vitro, ya sea en el páncreas perfundido aislado, en los acinos aislados o en las preparaciones de lóbulos aislados en las que la CCK fue el estímulo (65,96,99,139,158). En el páncreas aislado de rata (43), la insulina exógena (10 mU ml-1) potenció significativamente la secreción de amilasa estimulada por la CCK y el carbacol, potenciación que fue inhibida significativamente por el SS. La falta de un efecto inhibidor directo del SS también se observó en células parietales caninas aisladas (106). De hecho, el SS a 1 µM no logró inhibir la respuesta secretora gástrica a la histamina, la metacolina y la pentagastrina, lo que respalda algunos de los datos mencionados anteriormente. Curiosamente, el SS-28 en la concentración alta de 10 µM fue capaz de estimular la liberación de amilasa de los acinos pancreáticos de cobayos hasta aproximadamente el 68% de la estimulada por 100 pM de caeruleína. También se obtuvo una respuesta secretora máxima idéntica a la iniciada por la caeruleína con dos análogos del SS-28, Nat S1-28 y SS28. En estas condiciones, el SS-14 no tuvo ningún efecto estimulante (33). Como explicación de este efecto secretor del SS-28 sobre los acinos, se propuso que el SS-28 puede interactuar con el receptor CCK a altas concentraciones (34), efecto inhibido por el DBcGMP, un antagonista del receptor CCK (105). Por otra parte, el hecho de que el SS-14 no inhiba la secreción enzimática estimulada de los acinos aislados puede deberse a la liberación en el medio de incubación de una proteasa activa, observada por primera vez en el jugo pancreático secretado, y capaz de degradar el SS-14 (127). Esta proteasa de serina fue purificada hasta la homogeneidad a partir del jugo pancreático puro de rata. Con un MW de aproximadamente 29 kDa, corresponde a la elastasa II pancreática de rata. Por lo tanto, si se secreta en el medio de incubación, degradaría el SS-14 e impediría cualquiera de sus efectos inhibitorios y, por lo tanto, explicaría en parte por qué el SS-14 no pudo mostrar sus efectos inhibitorios sobre la liberación de la enzima in vitro (151). También podría afectar a la respuesta secretora al SS-28 a concentraciones más bajas en el medio de incubación. Otra posibilidad podría ser que los agentes movilizadores del calcio celular disminuyan la afinidad de los receptores de somatostatina de las células acinares por la somatostatina (33).
Efectos sobre el crecimiento
El crecimiento normal de un organismo resulta de un complejo equilibrio de las hormonas implicadas, como la hormona del crecimiento, la insulina y las hormonas tiroideas. Dado que la somatostatina puede inhibir la liberación de muchas hormonas, su neutralización debería estimular su secreción y, por tanto, aumentar el crecimiento. Este enfoque de autoinmunización contra la somatostatina para estimular el crecimiento se ha probado en corderos. Cuando se obtuvieron títulos significativos de anticuerpos, la tasa de aumento de peso fue mayor en los animales inmunizados con SS y se acompañó de un aumento de la altura. En estos corderos inmunizados, hubo una mayor respuesta de la hormona del crecimiento a la estimulación con arginina, así como niveles sanguíneos basales más altos de somatomedina (143). Estos datos se confirmaron posteriormente también en esta especie (75). Cuando se administró a ratas implantadas por vía subcutánea con una minibomba Alzet, la somatostatina administrada a 1,5 µg h-1 durante 14 días no tuvo ningún efecto sobre su aumento de peso. Sin embargo, la infusión de un antagonista de la somatostatina condujo a un aumento significativo de la ganancia de peso con respecto al control (144).
En la rata, la inyección diaria de somatostatina-14 a 390 µg kg-1 día-1 en gelatina durante tres semanas no tuvo ningún efecto sobre el peso corporal, pero redujo las densidades de células parietales y pépticas por milímetro cúbico en comparación con los controles. Sin embargo, antagonizó el efecto promotor del crecimiento de la liberación de gastrina exógena (130 µg kg-1 día-1) y endógena tras la translocación del antro al colon, causando hipergastrinemia. En estos animales transpuestos al antro, el aumento de peso del páncreas se redujo significativamente con somatostatina (400 µg kg-1 día-1) durante 3 semanas (80). Durante un período de 5 días, la somatostatina-14 s.c. en gelatina a dosis de 11, 33 o 100 µg kg-1 cada 8 h causó disminuciones significativas de las concentraciones de amilasa, quimotripsina y proteínas pancreáticas y del contenido total de ADN sólo en las dos dosis más altas, sin ningún efecto sobre el peso pancreático total. Sin embargo, las tasas de síntesis de proteínas, ARN y ADN se redujeron significativamente inmediatamente después de cada inyección de somatostatina durante 24 horas (92). La somatostatina-14, también administrada s.c. en gelatina a una dosis de 600 µg kg-1, tres veces al día durante 2 y 4 días, redujo significativamente los efectos tróficos de la caeruleína (1 µg kg-1, tres veces al día) con un fuerte efecto sobre el contenido total de ADN. Curiosamente, la inmunoneutralización contra el SS-14 aumentó significativamente todos los parámetros de crecimiento estudiados por encima de los observados en respuesta a la caeruleína (93). Se observaron efectos inhibidores similares con la administración prolongada de somatostatina de acción prolongada, SMS 201-995 (54). La desviación del jugo pancreático en la rata provoca una importante liberación de CCK endógena que da lugar a un aumento del crecimiento pancreático (89). Utilizando este procedimiento de desviación del jugo biliar-pancreático, dicha técnica aplicada 8 h al día-1 durante 4 días condujo a aumentos significativos del peso pancreático y de la CCK sérica; ambos efectos se redujeron significativamente con el SMS 201-995 infundido a una dosis de 5 µg kg-1 h-1 y con el L-364,718, un antagonista del receptor de la CCK-1, administrado a 0,5 mg kg-1 h-1. En estas condiciones, tanto el SMS como el L-364,718 fueron equipotentes en la reducción del crecimiento del páncreas, mientras que el SMS fue el único antagonista capaz de reducir a un nivel basal la CCK endógena liberada por la derivación pancreático-labial (119). Estos datos indican que la somatostatina y sus análogos pueden reducir el crecimiento pancreático estimulado por la CCK exógena y liberada endógenamente. Por último, se observó que la somatostatina (SMS) infundida a una tasa de 5 µg kg-1 h-1 durante 2 días fue capaz de prevenir totalmente los aumentos del peso pancreático y del contenido total de ARN y ADN inducidos por la caseína en un 70% (94). Esta es otra prueba de que la somatostatina puede controlar el crecimiento pancreático inducido por la CCK endógena liberada por una dieta rica en proteínas (50). Administrado solo como infusión iv durante 7 días a una dosis de 5 µg kg-1 h-1, el SMS 201-995 causó reducciones significativas en el peso pancreático e intestinal acompañadas de disminuciones en el ADN y ARN totales en ambos órganos. La CCK y el IGF-1 plasmáticos se redujeron, mientras que el contenido total de IGF-1 pancreático aumentó (120). Además de la CCK endógena, algunas observaciones sugieren la posible participación del IGF-1 en el proceso de control positivo del crecimiento en el intestino y el páncreas. En efecto, este factor de crecimiento está presente en el intestino (28) y el páncreas (56) y se han documentado receptores específicos en las células de estos órganos (76,162); se han postulado mecanismos de acción paracrinos o autocrinos (29). La somatostatina puede actuar en el control de estos dos órganos a través de una inhibición de la liberación de IGF-1 acompañada de un efecto similar sobre la CCK intestinal.
Efectos de la somatostatina en los tumores pancreáticos
La somatostatina se ha caracterizado como el «interruptor universal de apagado» porque inhibe la mayoría de las funciones orgánicas y celulares con las que se ha asociado. Se ha sugerido un papel para la somatostatina y sus análogos en los tratamientos del cáncer de páncreas porque estas moléculas proporcionaron inicialmente una terapia adyuvante positiva y no tóxica.
En el hámster sirio dorado implantado por vía subcutánea con células de adenocarcinoma pancreático ductal WD, un tratamiento crónico de 21 días con el análogo de la somatostatina (L-5-Br-Trp8)SS a una dosis de 20 µg b.i.d., disminuyó el peso del tumor en un 44% y el volumen del mismo en un 22% (114). También se ha demostrado que la somatostatina y su análogo RC-160 inhiben los cambios preneoplásicos y disminuyen la incidencia de tumores en hámsters expuestos al carcinógeno pancreático BOP; estos tratamientos provocaron aumentos en el número de células tumorales apoptóticas (150). En otro estudio, el número de receptores de somatostatina aumentó en las células tumorales tras el tratamiento con RC-160 (35). El crecimiento de las células MIAPaCa-2 implantadas s.c. en ratones desnudos se inhibió de forma dependiente de la dosis mediante inyecciones de octreotida dos veces al día a 250 y 2500 µg kg-1 (160). Utilizando otro modo de administración del fármaco, las microcápsulas, el RC-160 administrado a 1250 µg kg-1 d-1 inhibió significativamente el crecimiento de los tumores MIAPaCa-2 en ratones desnudos (110). El fracaso de la somatostatina o de sus análogos en la inhibición del crecimiento tumoral podría deberse a la ausencia del receptor de SS, como se ha demostrado en las células humanas de cáncer de páncreas PGER, que son irresponsables al SMS 201-995 (141). En las células MIAPaCa-2 y PANC-1 cultivadas en DMEM con 10% de suero de ternera fetal, 1 µM de SS-14 y SMS 201-995 inhibieron el crecimiento de las células PANC-1 con la activación de la tirosina fosfatasa SHP-1. Por el contrario, el SS y su análogo provocaron el crecimiento de la célula MIAPaCa-2 y este efecto de crecimiento puede ser el resultado de la ausencia de SHP-1 en estas células (31). En las células que responden a la somatostatina, se demostró anteriormente que la SHP-1 se copurificaba con el receptor de somatostatina (167). En las células BON (células carcinoides pancreáticas humanas) se observó un efecto similar de estimulación del crecimiento a dosis de 1 nM y 100 nM; este efecto de crecimiento se acompañó de reducciones significativas en el contenido de AMPc de las células sin afectar a la hidrólisis de PI (66).
La mayoría de los ensayos clínicos con análogos de la somatostatina en el tratamiento adyuvante del cáncer de páncreas no han demostrado una respuesta. No se observó ningún efecto antitumoral en 14 pacientes con cáncer de páncreas metastásico con tres inyecciones diarias s.c. de 100-200 µg de SMS durante 7 semanas (72). En otro estudio, diecinueve pacientes con carcinoma pancreático exocrino avanzado recibieron el análogo de la somatostatina BIM23014 de 250 µg a 1 mg día-1 durante 2 meses. Dentro de este grupo, un paciente tuvo una respuesta parcial, 6 tuvieron enfermedades estables y once tuvieron enfermedad progresiva (20). A partir de los estudios realizados en diferentes células de cáncer de páncreas y de las diversas respuestas obtenidas sobre su crecimiento, parece que una de las claves del éxito en la batalla crítica contra el cáncer de páncreas es la expresión de receptores específicos de somatostatina y el uso del análogo específico (37). Las propiedades de los cinco subtipos clonados de receptores de somatostatina humanos y las indicaciones establecidas, probables y no establecidas para el uso de análogos de somatostatina se han resumido en la referencia 77.
Uso clínico de la somatostatina
Clinicamente, la octreotida se ha utilizado en el tratamiento de la pancreatitis aguda, pero no se ha confirmado un beneficio unánime. En un ensayo (111), la somatostatina se administró en una dosis inicial en bolo de 250 µg seguida de 250 µg h-1 como infusión continua; el tratamiento en 9 de 12 pacientes con pancreatitis aguda revirtió la amilasemia y aportó una mejora clínica, pero no logró mostrar ninguna reducción de las tasas de mortalidad. No obstante, la somatostatina sigue siendo un tratamiento eficaz para las complicaciones locales establecidas de la pancreatitis aguda, como las fístulas pancreáticas y los pseudoquistes (112). En un estudio, los pacientes con tumores endocrinos pancreáticos metastásicos fueron tratados inicialmente con 50 µg de octreotida s.c. cada 12 h y posteriormente (6-16 meses) se aumentó la dosis a 500 µg cada 8 h. Algunos pacientes no respondieron al tratamiento, mientras que en otros fue eficaz; los síntomas mejoraron, pero finalmente reaparecieron y todos los pacientes murieron una vez alcanzada la fase de resistencia de su enfermedad (163). Estos datos indican que la somatostatina no es el tratamiento ideal para la pancreatitis, pero puede ser útil para tratar las complicaciones locales de la enfermedad. Sin embargo, el SMS ha demostrado ser muy eficaz para eliminar la diarrea pancreática y permitir la corrección de la deshidratación y la acidosis. Su efecto se tradujo en la marcada reducción de las concentraciones plasmáticas de VIP (84).
3. Herramientas para el estudio de la somatostatina
a) Péptidos
Somatostatina-14 y -28 están disponibles comercialmente. El principal agonista utilizado in vivo es la octreotida (SMS 201-995) y los demás son: RC-160, BIM-23014, BIM-23056, BIM-23027 y L-362,855. De la serie BIM, el BIM-23056 actúa como agonista del receptor SST-3 y como antagonista del receptor SST-5 (161). Las estructuras químicas de estas moléculas se presentan en la Tabla 1.
b) Anticuerpos y ensayos
En muchos laboratorios se han desarrollado anticuerpos contra la somatostatina -14, -28, SMS 201-995 y RC-160. A modo de ejemplo, Guillemin ha creado un RIA utilizando un antisuero ovino BARBAR-78; este antisuero fue criado contra el SS-14 sintético y reacciona de forma cruzada con el SS-28 ovino sintético en proporción equimolar (15). También se desarrolló un antisuero específico contra el SS-28 (67) y también se han establecido RIA para el SMS 201-995 (5) y el RC-160 (83).
c) Modelos experimentales
La mayoría de los estudios fisiológicos realizados en humanos se hicieron en voluntarios sanos de ambos sexos (30). Entre los animales de experimentación, los estudios se realizaron sobre todo en perros conscientes con fístulas gástricas y pancreáticas (146,147), en ratas conscientes con el jugo biliar-pancreático desviado (25,127) y en ratas anestesiadas (39). Para el efecto crónico de la somatostatina en el páncreas, se trataron ratas diariamente con inyecciones s.c. de somatostatina (92). Los estudios in vitro se realizaron generalmente con acinos pancreáticos recién preparados, lóbulos aislados o páncreas perfundido aislado de rata, ratón o cobaya (65, 96,139,158). En la Tabla 2 se presentan algunos datos sobre las especies animales utilizadas, las dosis o concentraciones de somatostatina y análogos administrados y los efectos.