COMENTARIO
La exclusión del colorante es una técnica sencilla y rápida para medir la viabilidad celular, pero está sujeta al problema de que la viabilidad se determina indirectamente a partir de la integridad de la membrana celular. Por lo tanto, es posible que la viabilidad de una célula se haya visto comprometida (medida por la capacidad de crecer o funcionar) aunque la integridad de su membrana se mantenga (al menos transitoriamente). A la inversa, la integridad de la membrana de la célula puede ser anormal y, sin embargo, la célula puede ser capaz de repararse a sí misma y llegar a ser totalmente viable. Otro problema potencial es que, dado que la captación de colorante se evalúa de forma subjetiva, pueden pasar desapercibidas pequeñas cantidades de captación de colorante que indiquen una lesión celular. En este sentido, la exclusión del colorante realizada con un colorante fluorescente utilizando un microscopio de fluorescencia da como resultado rutinario la puntuación de más células no viables con captación de colorante que las pruebas realizadas con azul tripán utilizando un microscopio de transmisión.
Un método más sofisticado para medir la viabilidad celular es determinar la exclusión del colorante mediante citometría de flujo. Esto puede hacerse utilizando el azul de tripán, ya que esta proteína se une a las proteínas y luego emite una señal de fluorescencia que puede detectarse en un citómetro de flujo (a 660 nm cuando se une a la albúmina de suero bovino) (véase la referencia 2 para obtener detalles sobre el uso del azul de tripán en la citometría de flujo). Alternativamente, la exclusión puede medirse con otros colorantes emisores de luz, como el yoduro de propidio (véase la Unidad 5.4 para una descripción del uso del yoduro de propidio en la evaluación de la viabilidad celular mediante análisis de citometría de flujo). La comparación detallada de las estimaciones de las células vivas frente a las muertas utilizando la exclusión del azul tripán evaluada manualmente como se describe aquí y la evaluada electrónicamente por citometría de flujo indican que las dos técnicas proporcionan resultados muy similares en manos experimentadas. Mientras que la técnica de exclusión del colorante descrita es más probable que dé lugar a errores debido a la subjetividad del operador, el enfoque de citometría de flujo es menos adecuado para la evaluación de la viabilidad celular durante la realización de técnicas de purificación celular complejas y que requieren mucho tiempo. Por lo tanto, una técnica de citometría de flujo es aplicable sólo cuando deben obtenerse mediciones precisas sobre el número de células muertas en una mezcla de células.
Recientemente, se ha informado de una «prueba de viabilidad automatizada con microscopio de fluorescencia» en la que la viabilidad celular utilizando yoduro de propidio junto con un dispositivo que cuenta las células vivas y muertas en un contador de células de microscopio portátil equipado con un microchip. Se dice que este contador puede evaluar la viabilidad celular más rápidamente que la técnica manual descrita aquí o el citómetro de flujo y obtener recuentos más precisos y fiables. Este dispositivo puede ser útil en situaciones en las que se requieren muchos ensayos de viabilidad celular adquiridos rápidamente (3).
Debe tenerse en cuenta que la viabilidad celular también puede evaluarse con colorantes que se unen al ADN (monoazida de etidio), agentes que se unen a la fosfatidilserina (Annexin V) y colorantes reactivos a la amina. El uso de estos agentes alternativos suele requerir citometría de flujo y, por lo tanto, sólo es aplicable en condiciones particulares.
La exclusión del azul de Tripán, como se describe en el protocolo anterior, puede realizarse en 5 a 10 minutos.