Presentación del caso
El presente reporte de caso se deriva de una visita veterinaria de rutina a una granja de 155 animales, con dos razas de ovejas (Pelifolk y Blackbelly), ubicada en Tesistán, municipio de Zapopan, estado de Jalisco, México. Las instalaciones de esta granja fueron adaptadas de una granja porcina anterior, y aún están rodeadas de granjas porcinas y bovinas en la vecindad cercana. El rebaño se mantenía en suelos elevados para facilitar la limpieza y el manejo, sin embargo, había muchos objetos punzantes asados (como alambre, vallas rotas, clavos, etc.) en los corrales y la limpieza no se realizaba adecuadamente en la granja en el momento de la inspección. La alimentación se basaba en piensos disponibles localmente, tales como: forraje de baja calidad, estiércol-silicio porcino y pienso concentrado comercial de alto contenido proteico. Esta granja llamó a los servicios veterinarios debido a los frecuentes abscesos cutáneos encontrados en los animales, no se reportaron otras quejas relacionadas con problemas de piel. Los abscesos no parecían afectar a la productividad de los animales, pero la presencia de tales lesiones afectaba negativamente a la comercialización de los animales, por lo que el propietario estaba interesado en conocer el agente etiológico y el tratamiento recomendado para eliminar la enfermedad de la explotación. Un veterinario certificado tomó muestras del contenido de los abscesos de 31 animales (29 ovejas, 1 carnero y 1 cordero) y las envió al laboratorio para su diagnóstico bacteriológico, con el fin de encontrar los agentes etiológicos que estaban causando el problema. Basándose en la apariencia de los abscesos, el diagnóstico presuntivo de la infección en la granja fue linfadenitis caseosa para la mayoría de los animales. Sin embargo, el análisis bacteriológico demostró que 13 animales estaban infectados por C. pseudotuberculosis, 1 por Corynebacterium spp., 2 por Proteus spp., 2 por Streptococcus spp. y en los 13 casos restantes no se pudo identificar el patógeno. La categorización del aislado de Corynebacterium spp. no estaba clara porque los resultados de las pruebas bacteriológicas y bioquímicas no eran concluyentes.
Este trabajo describe el aislamiento de C. xerosis de un cordero Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) de 4 meses de edad en buena condición corporal. Hasta donde sabemos, este es el primer informe de C. xerosis que produce un absceso cutáneo clínico en ovejas. Se obtuvo el consentimiento informado del propietario del animal para la publicación de los resultados del estudio clínico, incluido el material fotográfico. El animal presentaba un absceso de consistencia dura, sin drenaje, en el lado izquierdo del cuello (Fig. 1a). El diagnóstico clínico inicial sugería una linfadenitis caseosa, posiblemente causada por C.pseudotuberculosis. Se obtuvo una muestra para el análisis bacteriológico mediante la punción del absceso con una jeringa estéril de 5 ml, con una aguja hipodérmica de calibre 20, tras limpiar y desinfectar la superficie del absceso. El tipo de exudado recuperado era de aspecto seroso y blanco. La muestra biológica se conservó a 4 °C hasta su caracterización biológica en el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15,5 carretera Toluca-Atlacomulco, Toluca, México, z.c. 50200). El tiempo entre el muestreo y el procesamiento no superó las 72 h. La muestra se cultivó por duplicado, en agar sangre de oveja al 8 % y se incubó de 24 a 48 h a 37 °C en condiciones aeróbicas y microaerófilas . Se observaron colonias de 1,0 mm de diámetro, no hemolíticas, de color marrón amarillento y de aspecto ligeramente seco (Fig. 2a). Estas características morfológicas no se correspondían con las descritas anteriormente para C. pseudotuberculosis, sino que parecían colonias de C. xerosis . Microscópicamente (aumento de 10×; Fig. 2c) las bacterias se observaron como bastoncillos grampositivos terminados en forma de garrote, pleomórficos y teñidos irregularmente. Las pruebas bioquímicas mostraron los siguientes resultados: Hierro triple azúcar (TSI,-), Agar hierro lisina (LIA,-), Prueba de citrato (CIT,-), Sulfuro Indol-Motilidad (SIM,-), Motilidad, Indol, Ornitina (MIO,-), Oxidativo-fermentativo (OF,-) Rojo de metilo (-), Agua de Peptona (-), Voger Pascaguer (-), Urea (-), Caldo de Nitrato (+), Trehalosa (+), Sacarosa (+), Maltosa (+) y Fermentación de la Glucosa (positiva a 37 °C y negativa a 42 °C). Estos resultados podrían corresponder a un perfil de C. pseudotuberculosis, con la excepción de la prueba de la urea, que fue negativa en lugar de positiva, y por lo tanto coincide mejor con un perfil de C. xerosis . Los resultados del diagnóstico no fueron concluyentes, por lo que, aunque el sistema API no es específico para identificar C. xerosis , decidimos estudiar el aislado con este sistema, para ver si este aislado podía ser identificado como otra especie de Corynebacterium. Además, para averiguar si este aislado pertenece a otras especies como C. freneyi y C. amycolatum que raramente se encuentran en las ovejas, probamos si la colonia era capaz de crecer a 20 °C y si era capaz de fermentar la glucosa a 42 °C. El aislado creció bien a 20 °C y no fermentó la glucosa a 42 °C, ambas características asociadas a C. xerosis y C. hansenii , por lo que decidimos realizar un análisis molecular para averiguar si podíamos identificar molecularmente el aislado como C. xerosis. Analizamos tres loci para aumentar la precisión de nuestro diagnóstico. Se analizó un gen normalmente ausente en C. xerosis pero presente en C. pseudotuberculosis, el gen pld, en el que esperábamos no encontrar ningún amplicón tras la prueba de PCR si el aislado era C. xerosis en oposición a C. pseudotuberculosis, que amplificaría una banda de 203 pb; un segundo locus tenía como objetivo la amplificación de la región espaciadora intergénica de los genes 16S-23S rRNA (16S-23S) utilizando cebadores diseñados para C. pseudotuberculosis, que se ha informado que no funcionan para C. xerosis , y también esperaríamos ninguna banda de amplificación para C. xerosis y una banda de 816 pb para C. pseudotuberculosis. Por último, realizamos la amplificación por PCR y la secuenciación del gen rpoB (446 pb), del que se ha informado previamente que permite diferenciar las especies de Corynebacterium . La extracción de ADN se realizó con un kit comercial (KAPA Express Extract) siguiendo el protocolo del fabricante. Se realizó una técnica de Multiplex-PCR para la amplificación de secuencias parciales de los genes pld, 16S-23S y rpoB siguiendo el protocolo publicado por Pacheco en 2007 . Las reacciones se llevaron a cabo utilizando un kit comercial de PCR múltiple (QIAGEN Multiplex PCR) siguiendo las especificaciones del fabricante. El análisis de la PCR incluyó las siguientes muestras: El aislado a caracterizar, el aislado putativo de C. xerosis, y dos C. pseudotuberculosis (un aislado local previamente caracterizado como biovar ovis y, una cepa de referencia, ATCC 43924, biovar equi) utilizados como controles. Como se esperaba para la putativa C. xerosis, se amplificó una sola banda de amplicón de 446 pb por PCR, correspondiente al fragmento del gen rpoB, y no se amplificaron los fragmentos intergénicos del gen 16S-23S ni del gen pld. También como se esperaba, ambas cepas de C. pseudotuberculosis mostraron tres bandas de 203, 446 y 816 pb, correspondientes a los genes pld, rpoB y 16S, respectivamente (Fig. 3). Los amplicones del gen RpoB de las tres muestras se purificaron utilizando el kit de purificación de Promega (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) y se enviaron para su secuenciación automática por Macrogen (Rockville, MD, USA). Se analizaron los alineamientos de secuencias múltiples obtenidos a partir de un BLAST (NCBI) junto con las secuencias de nuestros aislados utilizando el análisis Clustal W de Mega 6.0.6 (Fig. 4). El análisis filogenético se realizó mediante el método de unión de vecinos (software MEGA 6.0.6). Los valores Bootstrap se obtuvieron generando 1000 árboles al azar. El análisis filogenético también incluyó las secuencias del gen rpoB de C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) y C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). Fue posible observar diferentes grupos filogenéticos que correspondían a especies particulares de Corynebacterium. Estos resultados, confirman que el aislado de este estudio (rpoB C53) es C. xerosis (Fig. 4).
Absceso estudiado. Se informó de un absceso de consistencia dura sin drenaje en la región del cuello de un cordero de 4 meses de edad
Cultivo bacteriológico in vitro de Corynebacterium xerosis y Corynebacterium pseudotuberculosis. Las bacterias se cultivaron en agar sangre de oveja al 8%. aEl Corynebacterium pseudotuberculosis (ATCC 43924) mostró colonias blanquecinas con hemólisis beta. bEl aislado de Corynebacterium xerosis, creció como pequeñas colonias de color marrón amarillento sin hemólisis. c Preparación de frotis con tinción de Gram de Corynebacterium xerosis que muestra bastones pleomórficos Gram positivos característicos, con extremos en forma de garrote
PCR múltiple. Amplificación de secuencias parciales de los genes 16S rRNA, rpoB y pld. Carril MW: marcador de peso molecular de 1 Kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Carril 1: control negativo (reacción sin ADN molde). Carril 2: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi. Carriles 3-4: aislado de Corynebacterium xerosis (10-0,001 ng de ADN, respectivamente). Carril 5: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis
Análisis bioinformático. a Muestra la alineación de las secuencias utilizadas para construir el árbol filogenético en (b). Se descargaron tres secuencias de GenBank: C. pseudotuberculosis biovar ovis (CP002924.1), C. pseudotuberculosis biovar equi (CP003540.2) y Corynebacterium xerosis (AY492233.1). Los otros tres fueron especímenes enviados para su secuenciación (Macrogen, Rockville, MD, EE.UU.): rpoB13 (aislado local caracterizado como C. pseudotuberculosis, biovar ovis), rpoB C1 (C. pseudotuberculosis, biovar equi, cepa de referencia ATCC43924) y rpoB C53 (aislado local, caracterizado como C. xerosis). b El árbol muestra la relación genética de Corynebacterium pseudotuberculosis y Corynebcaterium xerosis para el gen rpoB. El árbol se construyó a partir del alineamiento de la secuencia parcial del gen. Los valores de Bootstrap se obtuvieron generando 1000 árboles aleatorios, y la fuerza de cada rama se indica en el nodo respectivo
Las técnicas de genotipado como la PCR, así como el análisis de la secuencia del aislado rpoB C53 en este estudio, contribuyeron en gran medida a una correcta identificación de la especie, que originalmente era errónea cuando se utilizaban las características fenotípicas microscópicas y bioquímicas. Corynebacterium xerosis se ha descrito anteriormente en muestras clínicas de casos humanos en lesiones de endocarditis, neumonitis, osteomielitis e infecciones cutáneas, especialmente en pacientes inmunodeprimidos. También se ha encontrado en muestras clínicas de animales, por ejemplo, en lesiones de hígado de cabra (sospecha de pseudotuberculosis), y en leche de vaca, de animales que presentan mastitis. En el ganado porcino, C. xerosis se ha aislado de lesiones en diferentes tejidos como el hígado, el riñón, el pulmón, el bazo y las articulaciones, así como de abscesos subcutáneos. Además, C. xerosis se ha aislado de muestras clínicas de útero de ovinos, en un caso de aborto, y de tejido pulmonar, de animales que presentaban problemas respiratorios. Estos aislados se identificaron y caracterizaron mediante la amplificación del gen 16S-23S del ARNr por PCR-RFLP. Sin embargo, en esos estudios no fue posible obtener un patrón de bandas lo suficientemente claro como para diferenciar C. xerosis de otras especies de Corynebacterium. Los autores también realizaron un análisis y comparación de secuencias de los genes 16S y rpoB, que les permitió diferenciar C. xerosis de otras especies, genéticamente similares a Corynebacterium .
Como se ha mencionado anteriormente, este estudio se realizó en base a la presencia del gen rpoB, que ha sido reportado por otros autores como el gen de elección para el análisis filogenético del género Corynebacterium, ya que presenta un alto polimorfismo, incluso mayor que la región del espaciador intergénico de los genes 16S-23S rRNA . Se sabe que los abscesos cutáneos en el ganado ovino (linfadenitis caseosa) están causados por C. pseudotuberculosis y su principal factor de virulencia y patogenicidad es la exotoxina fosfolipasa D, codificada por el gen pld y expresada en la membrana celular de la bacteria . Esta exotoxina es un factor de permeabilidad que promueve la hidrólisis de los enlaces éster de la esfingomielina en las membranas celulares de los mamíferos, lo que posiblemente contribuye a la propagación de las bacterias desde el lugar inicial de la infección a lugares secundarios a través del sistema linfático hasta los ganglios regionales, y parece estar implicada en la reducción de la viabilidad de los macrófagos tras la infección . La exotoxina también provoca lesiones dermonecróticas . Sin embargo, esta exotoxina no se ha descrito en C. xerosis como una toxina patógena que pudiera contribuir al desarrollo de abscesos. Esto subraya la importancia de llevar a cabo más investigaciones sobre los mecanismos de infección presentes en esta especie de Corynebacterium.
Un punto importante de discusión de naturaleza epidemiológica, incluye el hecho de que el sistema de producción ovino, de donde se obtuvo la muestra, fue utilizado previamente para el ganado porcino, una especie en la que C. xerosis ha sido reportado como un patógeno común . Además, uno de los principales ingredientes de la dieta de las ovejas incluye subproductos porcinos (estiércol-silaje porcino), que podrían tener eventualmente patógenos activos, tal vez incluyendo Corynebacterium spp. Además, los objetos punzantes, como varillas metálicas, clavos y alambres, están extendidos por todas las instalaciones, lo que aumenta la posibilidad de que los animales se lesionen, abriendo una vía de entrada de Corynebacterium spp. al organismo, incluyendo C. xerosis. Todos estos factores pueden haber contribuido a la presencia de C. xerosis dentro de la instalación. No se realizaron más estudios, pero las recomendaciones para el propietario fueron desbridar y desinfectar los abscesos de todos los animales, en una zona que contuviera la infección (para evitar la propagación de los patógenos), reforzar la limpieza de los corrales y eliminar todos los bordes y objetos afilados de las vallas, comederos y suelos. Dado que C. xerosis, al igual que C. pseudotuberculosis, son microorganismos potencialmente zoonóticos, se recomendó al ganadero que extremara las precauciones durante la manipulación de los animales y de los residuos producidos por la explotación para evitar la infección humana y animal y la posible propagación del microorganismo a otras explotaciones.