La prueba de Ames es un ensayo biológico para evaluar el potencial mutagénico de los compuestos químicos. Utiliza bacterias para comprobar si una determinada sustancia química puede causar mutaciones en el ADN del organismo de prueba. La prueba fue desarrollada por Bruce N. Ames en la década de 1970 para determinar si una sustancia química en cuestión es un mutágeno.
Objetivo
Determinar la actividad mutagénica de las sustancias químicas observando si causan mutaciones en las bacterias de la muestra.
Principio
- La prueba de Ames utiliza varias cepas de bacterias (Salmonella, E.coli) que son portadoras de una determinada mutación.
- Se realizan mutaciones puntuales en el operón de la histidina (Salmonella typhimurium) o del triptófano (Escherichia coli), lo que hace que la bacteria sea incapaz de producir el aminoácido correspondiente.
- Estas mutaciones dan lugar a organismos his- o trp- que no pueden crecer a menos que se les suministre histidina o triptófano.
- Pero al cultivar Salmonella His- en un medio que contenga ciertas sustancias químicas, se produce una mutación en el gen que codifica la histidina, de forma que recuperan la capacidad de sintetizar histidina (His+). Es decir, cuando se produce un evento mutagénico, las sustituciones de bases o los cambios de marco dentro del gen pueden causar una reversión a la prototrofia de aminoácidos. Esta es la mutación inversa.
- Estas bacterias revertidas crecerán entonces en medios deficientes en histidina o triptófano, respectivamente.
El potencial mutagénico de una muestra se evalúa exponiendo a los organismos que requieren aminoácidos a concentraciones variables de productos químicos y seleccionando el evento de reversión. Para esta selección se utilizan medios que carecen del aminoácido específico, lo que permite que sólo sobrevivan y crezcan las células que han sufrido la reversión a la prototrofia de histidina/triptófano. Si la muestra de ensayo provoca esta reversión, es un mutágeno.
Método
I ) Aislar una cepa de Salmonella Typhimurium auxotrófica para la histidina. (es decir, His-ve)
II) Preparar una suspensión de prueba de Salmonella Typhimurium his-ve en un tampón simple con producto químico de prueba (por ejemplo, 2-aminofluoreno). Añada también una pequeña cantidad de histidina.
Nota: se necesita una pequeña cantidad de histidina para que las bacterias empiecen a crecer. Una vez agotada la histidina, sólo las bacterias mutadas para obtener la capacidad de sintetizar histidina forman colonias.
III) Prepare también una suspensión de control de Salmonella Typhimurium His-ve pero sin productos químicos de prueba.
IV) Incubar las suspensiones a 37°C durante 20 minutos
V) Preparar las dos placas de agar y extender la suspensión en la placa de agar.
VI) Incubar las placas a 37°C durante 48 horas.
VII) Después de 48 horas, cuente el número de colonias en cada placa.
Interpretación de los resultados
- La mutagenicidad de los productos químicos es proporcional al número de colonias observadas.
- Si hay un gran número de colonias en la placa de prueba en comparación con el control, se dice que dichos productos químicos son mutágenos.
- También puede verse un número muy reducido de colonias en la placa de control. Esto puede deberse a una mutación puntual espontánea en el gen que codifica la hisidina.
Usos
Aunque la prueba de Ames se utiliza para identificar las mutaciones revertidas que están presentes en las cepas, también puede utilizarse para detectar la mutagenicidad de muestras ambientales como fármacos, tintes, reactivos, cosméticos, aguas residuales, pesticidas y otras sustancias que se solubilizan fácilmente en una suspensión líquida.
Merece la pena
- Se trata de un ensayo bacteriano sencillo, rápido y robusto.
- La facilidad y el bajo coste de la prueba la hacen inestimable para el cribado de sustancias en nuestro entorno por su posible carcinogenicidad.
- La prueba de Ames puede detectar mutantes adecuados en grandes poblaciones de bacterias con alta sensibilidad.
Limitaciones
- Algunas sustancias que provocan cáncer en los animales de laboratorio (la dioxina, por ejemplo) no dan un resultado positivo en la prueba de Ames (y viceversa)
- El ensayo de Ames consiste en cepas de Salmonella typhimurium, por lo que no es un modelo perfecto para el ser humano.