Susceptibilidad antimicrobiana in vitro de Aerococcus urinae a 14 antibióticos, y curvas de tiempo para penicilina, gentamicina y vancomicina

Abstract

Aerococcus urinae es un recién llegado a la práctica clínica y microbiológica, causante de infecciones del tracto urinario, bacteriemia/septicemia y/o endocarditis. Este estudio presenta por primera vez una evaluación de la actividad de un panel representativo de antibióticos contra un gran número de aislados de A. urinae. Se determinaron las susceptibilidades in vitro (CIM) de 56 aislados de A. urinae a 14 antibióticos mediante dilución en agar. En general, los aislados de A. urinae mostraron poca variabilidad entre los aislados, y tuvieron bajas CMI de penicilina, amoxicilina, piperacilina, cefepime, vancomicina y rifampicina. No se encontró resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos en ninguno de los aislados. Se observó una actividad de moderada a buena con las quinolonas, la eritromicina y la tetraciclina. Los aislados de dos pacientes con endocarditis se estudiaron con curvas de tiempo de eliminación de la penicilina, la gentamicina y la vancomicina. La penicilina y la vancomicina solas mostraron una actividad bactericida lenta o nula contra las dos cepas. Al combinar penicilina o vancomicina con gentamicina, se obtuvo una rápida actividad bactericida para ambas cepas con ambas combinaciones. Las opciones de tratamiento para A. urinae parecen incluir las penicilinas para los casos menos graves. En los casos graves, es decir, la endocarditis, las investigaciones sobre el tiempo de espera sugieren un efecto beneficioso de la combinación con gentamicina. En el paciente alérgico a la penicilina, la vancomicina en combinación con gentamicina representa la alternativa más obvia.

Introducción

Durante la última década se ha prestado mucha atención a la relevancia clínica de varios cocos Gram positivos catalasa-negativos.1 Entre ellos, Aerococcus urinae es un recién llegado a la práctica clínica y microbiológica, notificado por primera vez en 19892 y designado en 1992.3A. urinae se reconocieron originalmente por su morfología celular (parecida a la de los estafilococos en la tinción de Gram) y sus características de crecimiento (parecidas a las de los estreptococos α-hemolíticos en agar sangre), una reacción negativa a la catalasa y un antibiograma muy constante que demostraba la sensibilidad a la penicilina y la resistencia a las sulfonamidas y los aminoglucósidos.2-En dos informes se han aislado cepas de A. urinae en el 0,4-0,8% de las muestras de orina examinadas.2,5 La mayoría de los pacientes en los que se aisló A. urinae eran ancianos con condiciones predisponentes y signos de infección del tracto urinario.2,4,5 Se han reconocido cepas causantes de infecciones del tracto urinario en Dinamarca, Suecia, Países Bajos, Francia, EE.UU., Canadá y países sudamericanos.6 También se ha aislado A. urinae en la sangre de pacientes que sufrían bacteriemia/septicemia urogénica con o sin endocarditis.7-11 Un estudio nacional realizado en Dinamarca entre 1987 y 1995 identificó 26 pacientes con A. urinae aislado de la sangre,6 lo que corresponde a 0,5 pacientes/año/1 millón de habitantes, y al 0,8% de los episodios de endocarditis infecciosa.8 Los episodios de bacteriemia/septicemia respondieron bien al tratamiento con β-lactámicos solos o en combinación con un aminoglucósido, a menos que la bacteriemia se complicara con endocarditis, en cuyos casos cinco de seis pacientes murieron. En un paciente se pudo cultivar A. urinae en la autopsia a partir de las válvulas, a pesar del tratamiento antibiótico aparentemente pertinente. Por lo tanto, hay que determinar el tratamiento óptimo de la endocarditis por A. urinae.

El análisis de los aislados de A. urinae mediante métodos de difusión en tableta/disco ha revelado la susceptibilidad a una amplia gama de agentes antimicrobianos, incluidos los antibióticos β-lactámicos y no β-lactámicos.5,6,12 Dado que los aislados de A. urinae se han asociado principalmente a infecciones del tracto urinario, cabe destacar que las cepas se han encontrado resistentes a las sulfonamidas y a otros antimicrobianos utilizados para el tratamiento de las infecciones del tracto urinario, como el cotrimoxazol, la trimetoprima, el ácido nalidíxico y las polimixinas.2,5,6,12 Recientemente, se ha investigado la susceptibilidad de dos aislados de A. urinae procedentes de pacientes con endocarditis mediante las CIM de siete antibióticos, y se han realizado curvas de tiempo para la penicilina en combinación con gentamicina o netilmicina.11 El presente estudio caracteriza además el patrón de susceptibilidad de 56 aislados de A. urinae de diversos orígenes geográficos. Se determinaron las CMI de 14 antibióticos, y para dos aislados se realizaron experimentos de curva de tiempo con penicilina, gentamicina y vancomicina, solos o en combinación, con el fin de obtener más información sobre los regímenes de tratamiento óptimos de las infecciones graves causadas por A. urinae.

Materiales y métodos

Estres

Se estudiaron 56 aislados clínicos de A. urinae, que incluían 42 cepas danesas (17 cepas de sangre y 25 de orina) y 14 cepas de orina no danesas: una de los Países Bajos (amablemente proporcionada por P. J. G. M. Rietra), cuatro de Suecia (amablemente proporcionadas por E. Falsen, Colección de Cultivos, Universidad de Gotemburgo) y siete cepas norteamericanas (amablemente proporcionadas por R. R. Facklam, The Streptococcus Laboratory, CDC, Atlanta, GA, USA). Se utilizaron las siguientes cepas de referencia Staphylococcus aureus ATCC 29213, S. aureus ATCC 25923, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATTC 25922 y Enterococcus faecalis ATCC 29212.

Agentes antimicrobianos

Se utilizaron los siguientes agentes antimicrobianos bencilpenicilina (Leo, Ballerup, Dinamarca); cefepima (Bristol-Myers Squibb, Wallingford, CT, EE.UU.); amoxicilina, ceftriaxona, eritromicina, amikacina, gentamicina, netilmicina, rifampicina, vancomicina (Sigma, St Louis, MO, EE.UU.); oxitetraciclina (Rosco, Taastrup, Dinamarca), piperacilina (Lederle, Pearl River, NY, EEUU), ciprofloxacina (Bayer, Leverkusen, Alemania); y esparfloxacina (Rhône Poulenc Rorer, Vitry, Francia).

Determinación de la CIM

Debido al fastidioso crecimiento de A. urinae, las condiciones de la prueba tuvieron que modificarse con respecto a las recomendaciones estándar para realizar las determinaciones de la CIM (es decir, suplemento de sangre al 5% del agar e incubación en una atmósfera de CO2 al 5% durante 48 h).13-15 Las CIM se determinaron por el método de dilución en agar. Se prepararon diluciones seriadas dobles de agentes antimicrobianos en agar Mueller-Hinton (Difco Laboratories GmbH, Augsburgo, Alemania) complementado con un 5% de sangre de caballo lisada. Se probaron antibióticos de 0,008 a 512 mg/L, excepto amoxicilina (0,032-256 mg/L), rifampicina (0,008-32 mg/L) y oxitetraciclina (0,008-2 mg/L). Los inóculos de 107 ufc/mL (104 ufc/punto) se prepararon a partir de cultivos en agar de una noche y se suspendieron en NaCl al 0,9%, y se aplicaron con un inoculador múltiple de 21 puntos (Denley Instruments Ltd, Billinghurst, Reino Unido). Los resultados se leyeron después de la incubación durante 2 días a 37°C en 5% de CO2. La CIM se leyó como la concentración más baja que mostraba el crecimiento de un máximo de tres colonias.

Investigaciones de la curva de destrucción

Se investigaron dos de los aislados sanguíneos probados (B1 y B8), ambos procedentes de pacientes con endocarditis. Las cepas se probaron contra la penicilina (MIC 0,125 y 0,6 mg/L, respectivamente), la gentamicina (MIC 256 y 64 mg/L, respectivamente) y la vancomicina (MIC 0.5 y 1 mg/L, respectivamente) en las siguientes concentraciones clínicamente obtenibles: penicilina 2 × y 10 × CIM (P2 y P10, respectivamente); vancomicina 4 × y 10 × CIM (V4 y V10, respectivamente); gentamicina 10 mg/L (G10); y las combinaciones penicilina + gentamicina y vancomicina + gentamicina en las siguientes concentraciones: P2G10, P10G10, V4G10 y V10G10, respectivamente. A t = -1 h, las colonias frescas cultivadas durante la noche se suspendieron hasta alcanzar c. 105 ufc/mL en tubos con caldo Todd-Hewitt precalentado. Los tubos se colocaron en un baño de agua a 37°C. A t = 0 h se añadieron a los tubos, por duplicado, antibióticos preparados inmediatamente antes del ensayo. Se utilizaron tres tubos sin antibióticos como control de crecimiento. Se tomaron muestras por duplicado a las 0, 3, 6 y 24 h de cada tubo. Las muestras se diluyeron en serie y se sembraron. El número de colonias supervivientes se contó después de la incubación durante la noche a 37 °C en aire ambiente en bolsas de plástico junto con papel de seda húmedo . Utilizando muestras de 20 μL, el número mínimo contable de bacterias fue de 50 ufc/mL. El efecto de arrastre se eliminó para los experimentos con penicilina-gentamicina añadiendo 100 μL de 100 000 U/mL de penicilinasa a cada placa. En los experimentos con vancomicina-gentamicina, el efecto de arrastre se eliminó por dilución. Una investigación piloto demostró el efecto de arrastre en la muestra de 100 pero no en la de 10-1, por lo que las ufc se contaron utilizando 200 μL de las muestras de 10-1, lo que sigue dando un límite de detección de 50 ufc/mL. Todos los experimentos se realizaron al menos dos veces en días distintos. La actividad bactericida se definió como la reducción del inóculo en al menos un 99,9% en 24 h. La sinergia (S), el efecto aditivo (A) y el antagonismo se definieron como: >2 log más de muerte (S), >1 y <2 log más de muerte (A) y >2 log menos de muerte, respectivamente, para la combinación en comparación con el mejor de los antibióticos individuales.

Resultados

Determinación de la CIM

Las CIM obtenidas para los 56 aislados se muestran en la Tabla. Utilizando los puntos de rotura para estreptococos recomendados por el NCCLS14,15 o por el Grupo Sueco de Referencia de Antibióticos (SRGA),16,17 los aislados fueron susceptibles a las penicilinas, mientras que se encontró una susceptibilidad reducida para las cefalosporinas probadas. Las CIM para los aminoglucósidos indicaron una susceptibilidad reducida para casi todos los aislados. Sin embargo, no se encontró resistencia de alto nivel a los aminoglucósidos (es decir, gentamicina > 1000 mg/L) en ninguno de los aislados. Todos los aislados eran sensibles a la vancomicina. La rifampicina fue el fármaco más activo probado con una CIM50 de 0,031 mg/L (rango <0,004-0,064 mg/L), excepto para un aislado con una CIM > 32 mg/L (pruebas repetidas). Las actividades de las quinolonas ciprofloxacina y esparfloxacina resultaron ser igualmente buenas.

Exámenes de la curva de muerte

En la Figura se presentan las curvas de tiempo de muerte promedio de cada experimento. La vancomicina sola (tanto 4 × como 10 × MIC) mostró actividad bactericida contra la cepa B1. En el caso de la penicilina, sólo se encontró actividad bactericida para 10 × CIM contra B8. Para ambos antibióticos el efecto bactericida fue lento, es decir, apareció por primera vez después de 24 h. La gentamicina no fue bactericida; en la mayoría de los experimentos se observó crecimiento. La penicilina en combinación con la gentamicina fue sinérgica y rápidamente bactericida para la cepa B8 tanto en P2G10 como en P10G10. Para la cepa B1, sin embargo, sólo se encontró un efecto bactericida aditivo y lento. Al combinar la vancomicina con la gentamicina se encontró un efecto bactericida rápido para ambas cepas. Se detectó un efecto sinérgico después de 3 h y 6 h para la cepa B8. Sin embargo, a las 24 horas, la actividad letal de la vancomicina era tan pronunciada que no fue posible detectar un efecto sinérgico. En el caso de la cepa B1 sólo se encontró un efecto aditivo. No se registraron efectos antagónicos en ninguno de los experimentos.

Discusión

Este estudio presenta por primera vez una evaluación de las CIM de un panel representativo de antibióticos contra un gran número de aislados de A. urinae obtenidos de pacientes con infección del tracto urinario, bacteriemia/septicemia y/o endocarditis. Para evaluar el uso de los antibiogramas con fines taxonómicos, se han examinado previamente las CMI de 15 antibióticos para 10 cepas de A. urinae,12 pero no se han presentado datos detallados.

A. urinae son organismos fastidiosos que requieren la suplementación de sangre en los medios de comunicación y, a veces, la incubación en una atmósfera enriquecida con CO2 y/o un período de incubación prolongado con el fin de obtener un crecimiento suficiente para probar la susceptibilidad a los antibióticos. Por lo tanto, las cepas no pudieron probarse utilizando las condiciones estándar descritas por el BSAC o el NCCLS.13-15 La necesidad de modificar las condiciones de cultivo es, sin embargo, un problema común para las bacterias grampositivas fastidiosas.18,19 Los aislados de A. urinae mostraron un patrón de susceptibilidad antimicrobiana similar al de los estreptococos α-hemolíticos con sólo pequeñas variaciones de susceptibilidad entre los aislados. Las CMI de los β-lactámicos para los aislados se encontraban típicamente dentro de cuatro pasos de dilución dobles, excepto para las cefalosporinas ceftriaxona y cefepima, que mostraron una mayor variación en la CMI (Tabla). Debido a la posible influencia de la incubación con CO2 (disminución del pH), hay que tener cuidado al juzgar la susceptibilidad a la tetraciclina (susceptibilidad sobreestimada) y a la eritromicina (susceptibilidad subestimada). Entre los aislados de A. urinae examinados, no se identificó ninguna resistencia de alto nivel frente a los aminoglucósidos probados, lo que deja abierta la posibilidad de un efecto sinérgico cuando se combina con un β-lactámico o con vancomicina (vide infra). A juzgar por las CIM, existen varias alternativas de tratamiento para las infecciones graves, ya que los aislados eran sensibles a las penicilinas, la vancomicina y la rifampicina (excepto un aislado). Las quinolonas seleccionadas, ciprofloxacina y esparfloxacina, también mostraron una buena actividad. Aunque se trata de un organismo fastidioso, los resultados obtenidos por los métodos de difusión en disco2,5,20 han sido acordes con las CIM presentadas en este estudio, lo que sugiere que puede obtenerse un resultado fiable utilizando estos métodos rutinarios de susceptibilidad.

Las directrices para el tratamiento de infecciones graves, como la septicemia con o sin endocarditis, deberían basarse de forma óptima en la experiencia clínica en estudios cuidadosamente diseñados, pero esto es difícil cuando se trata de bacterias raras. Por lo tanto, los estudios in vitro que incluyen técnicas de curvas de mortalidad pueden aportar información importante para el clínico en estos casos.

Para los experimentos se eligieron concentraciones de antibióticos alcanzables in vivo. Para la gentamicina se eligió una dosis de 10 mg/L, que corresponde a la concentración obtenida con una dosis diaria de 240 mg (equivalente a 3-4 mg/kg).21 Además, aunque varios trabajos abogan por una dosis de dos veces al día para la endocarditis, en Dinamarca se utiliza habitualmente la gentamicina una vez al día, debido a la reducción de la nefrotoxicidad y al hecho de que el efecto sinérgico con los antibióticos β-lactámicos aumenta con el incremento de las concentraciones de aminoglucósidos.22 Los datos obtenidos en nuestro estudio in vitro de las curvas de mortalidad de la penicilina y la vancomicina mostraron que ni la penicilina ni la vancomicina eran bactericidas contra ninguno de los dos aislados probados de pacientes con endocarditis infecciosa. Cuando se combinó con gentamicina, se obtuvo un efecto bactericida contra ambos aislamientos tanto para la penicilina como para la vancomicina. Afortunadamente, estos regímenes se recomiendan para el tratamiento de la endocarditis infecciosa de etiología desconocida en todo el mundo.23 Las tasas de mortalidad de las dos cepas fueron diferentes, lo que indica que pueden existir variaciones entre las cepas. A pesar de la susceptibilidad in vitro a los antibióticos administrados, comprobamos que el pronóstico era malo para los pacientes de edad avanzada que sufrían endocarditis infecciosa causada por A. urinae.8 Los presentes resultados para la penicilina, la gentamicina y la netilmicina (CIM) coinciden con los del reciente informe suizo de Zbinden et al.11 para dos aislados de A. urinae procedentes de pacientes con endocarditis.

Las opciones de tratamiento para A. urinae parecen incluir las penicilinas para los casos menos graves. En los casos graves, es decir, en la endocarditis, las investigaciones de tiempo de espera sugieren un beneficio de la combinación de penicilina o vancomicina con gentamicina. En el paciente alérgico a la penicilina, la vancomicina representa la alternativa más evidente.

Tabla.

MICs de 14 agentes antimicrobianos der A. urinae (n = 56)

El límite superior de susceptibilidad para los estreptococos según el NCCLS15 o por SRGA16,17 marcado con sombreado gris.

aNúmero de cepas.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L

Tabla.

MIC de 14 agentes antimicrobianos der A. urinae (n = 56)

El límite superior de susceptibilidad para los estreptococos según el NCCLS15 o por SRGA16,17 marcado con sombreado gris.

aNúmero de cepas.

bMIC *< 0,032 mg/L.

cMIC > 32 mg/L.

dMIC > 2 mg/L