A transzwell migrációs próba egy klasszikus technika, amely lehetővé teszi a tudósok számára a sejtek mozgásának számszerűsítését. A migráció a sejtek azon képességére utal, hogy egyenként vagy csoportosan mozognak. A sejtek mozgását citoszkeletonjuk pontos átstrukturálása teszi lehetővé, és a migráció általában jelzésekként ható ingerek hatására történik.
A mai napon a transwell migrációs próbát fogjuk megvitatni, amely egy egyszerű kamrafelállítást használ a vonzó jelzésekre adott migráció értékelésére.
A transzwell-kamrával kapcsolatos háttérinformációkkal kezdjük.
A készüléket először Dr. Stephen Boyden tervezte 1961-ben, aki a leukocita-migráció tanulmányozására használta. Ezért ezt a módszert Boyden-kamrás vizsgálatnak is nevezik.
Egy egyszerű Boyden-kamrában a külső fal a lyukakból áll, mint a 96 lyukú tányérokban. Minden egyes lyuk belsejében egy transzwell, azaz egy hengeres betét van elhelyezve. A betét egy meghatározott pórusméretű polikarbonát membránnal rendelkezik. A lyukba helyezve a kamrát két rekeszre osztja. A felső rekeszbe azokat a sejteket ültetik, amelyek vándorlási viselkedését vizsgálni kívánják, az alsó rekeszbe pedig a kemoattraktáns oldatot helyezik. Definíció szerint a kemoattraktáns olyan molekula, amely a sejtek “vonzásával” képes elősegíteni a sejtek mozgását.”
A vonzó erők hatására a felső rekeszben lévő sejtek a pórusokon keresztül az alsó tartályba vándorolnak. Ha a sejtek tapadó tulajdonságokkal rendelkeznek, mint például egyes melanómasejtek, a mozgást követően a membrán alsó oldalához “tapadnak”. Ebben az esetben a membrán rögzíthető, megfesthető, és a sejtek mikroszkóp alatt megszámlálhatók. Másrészt a nem tapadó sejtek, mint például a spermiumok, az alsó tartályba vándorolnak. Ebben az esetben a tárolóoldatban lévő sejteket hemocitométer segítségével lehet megszámolni.
Bár a vizsgálat beállítása egyszerű, a kísérlet előtt több dolgot is figyelembe kell venni. Tekintsünk át néhányat közülük.
A vetési oldattal kezdve meg kell győződnie arról, hogy a sűrűség optimális a sejtvándorlás megfigyeléséhez. A túl kevés sejt kimutathatatlan migrációt eredményezhet, a nagyobb sűrűségek pedig túlnépesítik a membránt, ami megnehezíti a migráció megszámlálását. A második szempont a betét pórusmérete. Ezt a sejttípustól függően gondosan kell megválasztani. Ha a pórusméret túl kicsi, a sejtek nem tudnak majd átjutni.
Valamint, ha a pórusméret túl nagy, a sejtek csak átesnek rajta, ami nem jelent migrációt. Végül, figyelemmel kell lenni a kemoattraktáns koncentrációjára és a migrációhoz szükséges inkubációs időre, mivel ezek kölcsönösen függenek egymástól. Az optimális koncentráció és a megfelelő inkubációs idő, amely alatt a koncentrációs gradiens fennmarad a rekeszek között, a kemo-attrakciónak köszönhetően sejtmigrációt indukál. Ezzel szemben az elhúzódó inkubációval együtt járhat a kemoattraktáns egyensúlyba kerülése az egész kamrában, ami a kémiai gradiens elvesztéséhez vezethet, ami megzavarhatja a kapott eredmények elemzését.
Ezeket a megfontolásokat szem előtt tartva tárgyaljunk egy, az adherens sejtek migrációjának mérésére használt protokollt.
A vizsgálandó sejteket proteázmentes közegben készítjük elő, mivel a proteázok denaturálhatják a fontos membránreceptorokat, és végső soron befolyásolhatják a migrációt. A sejtek előkészítése után a szuszpenziót optimális vetési sűrűségre kell hígítani. A kamra elkészítéséhez a transzsejteket egy többsejtű lemez mélyedéseibe helyezzük. A sejtszuszpenziót a membrán érintése vagy légbuborékok bevezetése nélkül kell a transzkamrába pipettázni.
A hemoattraktáns oldatot az alsó tartályba pipettázzuk, ügyelve arra, hogy az oldat érintse a betét membránját. A migráció inkubációs ideje a kísérleti megfontolásoktól függ. Az inkubációt követően a membránokat 70%-os etanolba mártva rögzítjük. Miután a betétet hagyjuk megszáradni, sejtfestő oldatot adunk hozzá.
A következőkben a sejteket körülbelül 30 percig inkubáljuk szobahőmérsékleten. Az inkubációt követően az inzerteket mosópuffer segítségével mossuk. Végül a membrán kivágható és mikroszkópos tárgylemezre helyezhető. A membrán alján lévő sejtek a kemoattraktánsok jelenlétében és hiányában vándorolt sejtek számát jelzik.
Mivel most már ráéreztünk a protokollra, nézzük meg röviden, hogyan használják ezt a módszert a kutatók a feltárásaik során.
Az egyik leggyakoribb alkalmazása ennek a vizsgálatnak az ismeretlen vegyületek kemoattraktív tulajdonságainak értékelése. Itt a tudósok a békaspermák úszási útvonalának vizsgálatára voltak kíváncsiak allurin jelenlétében, amely egy olyan anyag, amelyet a kétéltűek petéi választanak ki. Ehhez először aktív békaspermiumokat pipettáztak a transzwell betétek tetejére. Az aljára allurint adtak. Miután hagyták a sejteket vándorolni, mikroszkóp alatt megszámolták a spermiumokat a tárolóoldatban. Ezzel a technikával képesek voltak egy koncentráció-válasz görbét létrehozni, amely az allurin koncentrációjának a spermiumok vándorlására gyakorolt hatását ábrázolja.
Amikor egy sejtet megtámadnak a kórokozók, kemoattraktánsokat bocsát ki, hogy immunsejteket toborozzon, amelyek vándorolnak, kötődnek, majd megszüntetik a fertőzést. E jelenség tesztelésére ezek a tudósok hámsejteket tenyésztettek a betétek alján. Ezt követően ezeket a sejteket különböző baktériumtörzsekkel fertőzték meg. Végül immunsejteket juttattak a felső kamrába. Ismeretes, hogy a fertőzött sejtek számos kemoattraktánst termelnek, amelyek az immunsejtek vándorlását indukálják. E kísérlet eredményei különböző mértékű neutrofil migrációt mutattak ki a különböző típusú bakteriális fertőzésekre adott válaszként.
Végül a rákos sejtek extracelluláris mátrixon keresztüli inváziója és metasztázisa mindig is izgatta a sejtbiológusokat. Itt a tudósok azt akarták meghatározni, hogy specifikus kemoattraktánsok hogyan járulhatnak hozzá az ilyen vándorláshoz egy 3D-s mátrixon keresztül. Genetikailag két különálló sejttömeget hoztak létre: az egyik zöld fluoreszcens, a másik vörös fluoreszcens fehérjét expresszált. Ezután egy extracelluláris mátrixot utánzó anyagot pipettáztak a transzkamrák tetejére.
A megszilárdulás után megfordították a transzkamrát, és a membrán alsó oldalára két sejtcsoportot vetettek. Ezután visszahelyezték a betétet a multiwell lemezbe, és a felső kamrába pipettázták a kemoattraktáns oldatot. Ez arra késztette az alul lévő sejteket, hogy felfelé és a 3D mátrixon keresztül mozogjanak. Konfokális képalkotás segítségével ezek a kutatók rekonstruálták a sejtvándorlást 3D-ben, és megkülönböztették a két sejtcsoport vándorlási mintázatát.
Az imént nézte meg a JoVE videóját a transzwell migrációs vizsgálatról. A módszer összetevőinek és protokolljának megértésével most már tudja, miért használják olyan széles körben a sejtbiológusok. A beállítás egyszerűsége ellenére a konfigurációk köre, amelyeket ez a módszer adaptálni tud, nélkülözhetetlenné teszi a sejtmozgékonysági vizsgálatokhoz. Mint mindig, köszönjük, hogy megnézték!