Ames-teszt egy biológiai vizsgálat a kémiai vegyületek mutagén potenciáljának értékelésére. Baktériumokat használ fel annak vizsgálatára, hogy egy adott vegyi anyag képes-e mutációkat okozni a vizsgált szervezet DNS-ében. A tesztet Bruce N. Ames fejlesztette ki az 1970-es években annak megállapítására, hogy egy adott vegyi anyag mutagén-e.
Cél
A vegyi anyagok mutagén aktivitásának meghatározása annak megfigyelésével, hogy okoznak-e mutációkat a minta baktériumaiban.
Elv
- Ames-teszt több baktériumtörzset (Salmonella, E.coli) használ, amelyek egy adott mutációt hordoznak.
- A hisztidin (Salmonella typhimurium) vagy a triptofán (Escherichia coli) operonban pontmutációkat hoznak létre, amelyek a baktériumot képtelenné teszik a megfelelő aminosav előállítására.
- Ezek a mutációk His- vagy trp- organizmusokat eredményeznek, amelyek nem tudnak növekedni, hacsak nem kapnak hisztidint vagy triptofánt.
- A His- Salmonella tenyésztése azonban bizonyos vegyi anyagokat tartalmazó táptalajon olyan mutációt okoz a hisztidint kódoló génben, hogy visszanyerik a hisztidin szintézisének képességét (His+). Ez azt jelenti, hogy egy mutagén esemény bekövetkezésekor a génen belüli báziscserék vagy frameshiftek az aminosav-prototrófia visszaállítását okozhatják. Ez a fordított mutáció.
- Ezek a revertált baktériumok ezután hisztidin-, illetve triptofánhiányos táptalajon fognak növekedni.
A minta mutagén potenciálját úgy vizsgálják, hogy az aminosav-igényes szervezeteket különböző koncentrációjú vegyszereknek teszik ki, és szelektálják a reverziós eseményt. Ehhez a szelekcióhoz a specifikus aminosavat nem tartalmazó közegeket használnak, amelyek csak a hisztidin/triptofán prototrófiára való visszaforduláson átesett sejtek túlélését és növekedését teszik lehetővé. Ha a vizsgálati minta ezt a reverziót okozza, akkor mutagénnek minősül.
Módszer
I ) Izoláljuk a Salmonella Typhimurium auxotróf törzsét hisztidinre. (azaz His-ve)
II) Készítsünk his-ve Salmonella Typhimurium teszt-szuszpenziót sima pufferben, tesztkémiai anyaggal (pl. 2-aminofluorén). Adjunk hozzá egy kis mennyiségű hisztidint is.
Megjegyzés: kis mennyiségű hisztidinre van szükség, hogy a baktérium növekedni kezdjen. A hisztidin kimerülése után csak azok a baktériumok képeznek kolóniákat, amelyek mutálódtak, hogy képesek legyenek hisztidin szintézisére.
III) Készítsen egy kontrollszuszpenziót is His-ve Salmonella Typhimuriumból, de tesztkémiai anyagok nélkül.
IV) Inkubáljuk a szuszpenziókat 37°C-on 20 percig
V) Készítsünk két agarlemezt, és terítsük a szuszpenziót az agarlemezre.
VI) Inkubáljuk a lemezeket 37°C-on 48 órán keresztül.
VII) 48 óra elteltével számoljuk meg a telepek számát mindegyik lemezen.
Eredmények értelmezése
- A vegyi anyagok mutagenitása a megfigyelt telepek számával arányos.
- Ha a tesztlemezen a kontrollhoz képest nagyszámú telep van, akkor az ilyen vegyi anyagot mutagénnek mondjuk.
- A kontrolllemezen is nagyon kevés telep látható. Ennek oka lehet a hisidint kódoló gén spontán pontmutációja.
Használatok
Míg az Ames-tesztet a törzsekben jelenlévő revertált mutációk azonosítására használják, a környezeti minták, például gyógyszerek, színezékek, reagensek, kozmetikumok, szennyvíz, peszticidek és más, folyékony szuszpenzióban könnyen oldódó anyagok mutagenitásának kimutatására is használható.
Erények
- Egyszerű, gyors és robusztus baktériumteszt.
- A teszt egyszerűsége és alacsony költsége felbecsülhetetlenné teszi a környezetünkben lévő anyagok esetleges rákkeltő hatásának szűrésére.
- Ames teszt nagy érzékenységgel képes kimutatni a megfelelő mutánsokat nagy baktériumpopulációkban.
Korlátozások
- Egyes anyagok, amelyek laboratóriumi állatokban rákot okoznak (pl. dioxin), nem adnak pozitív Ames-tesztet (és fordítva)
- Ames-teszt Salmonella typhimurium törzsekből áll, ezért nem tökéletes modell az emberre nézve.