GyrB és GyrA expresszió és tisztítás
A teljes hosszúságú E. coli GyrA-t (2-875) kódoló szekvenciát egy módosított, N-terminális 10-His tag-et és C-terminális Twin-strep tag-et tartalmazó pET28b-be illesztettük. Az overexpressziót E. coli BL21 (DE3) pRARE2-ben, 50 µg/mL kanamicint és 35 µg/mL klóramfenikolt tartalmazó LB táptalajon végeztük. A sejteket 0,35 mM IPTG-vel indukáltuk, miután elérték a 0,85 OD600 értéket, és a fehérjét 37 °C-on 4 órán keresztül expresszáltuk. A sejteket leszedtük és lízispufferben (20 mM Hepes, 500 mM NaCl, 20 mM imidazol, 10% v/v glicerin, pH 8,0) reszuszpendáltuk, majd három ciklusos nagynyomású bontással lizáltuk az EmulsiFlex-C3 segítségével 1500 bar nyomáson. A GyrA fehérjét nikkel-affinitás kromatográfiával tisztítottuk kézzel töltött XK 26/20 oszlopon (Pharmacia), Ni2+ ionokhoz kötött chelating Sepharose 6 Fast Flow gyantával (GE Healthcare). Az eluálást 250 mM imidazol pH 8,0-t tartalmazó lízispufferrel végeztük, és az eluált fehérjéket közvetlenül 10 ml Streptavidin szefarózra (GE Healthcare) rögzítettük. A fehérjéket Strep pufferrel (20 mM Hepes, 60 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerin, pH 8,0) alaposan mostuk, majd 3 mM desztiobiotint (Sigma-Aldrich) tartalmazó Strep pufferrel eluáltuk. Mind a 10-His tag-et, mind a Twin-strep tag-et ezt követően PreScission proteázzal (P3C) és Tobacco Etch Virus (TEV) hasítással (tömegarány 1:1:50 P3C-TEV-GyrA) hasítottuk egy éjszakán át 4 °C-on. A GyrA-t ezután tovább tisztítottuk egy anioncserélő kromatográfiás lépéssel HiTrap Q HP oszlop (GE Healthcare) segítségével. A fehérjét 20 oszloptérfogat lineáris gradiensével eluáltuk B pufferrel (20 mM Hepes, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 10% v/v glicerin, pH 8,0). A GyrA-t tartalmazó frakciókat összevontuk és egy Superdex S200 16/60 méretkizáró kromatográfiás oszlopra (GE Healthcare) töltöttük 20 mM Hepes, 50 mM NaGlu, 50 mM KAc, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 10% v/v glicerin, pH 8,0 használatával. 3 L tenyészetből 37 mg GyrA-t nyertünk. A GyrB (2-804) kódoló szekvenciát ugyanabba a módosított pET28b-be illesztettük be. Az overexpressziót E. coli BL21 (DE3) pRARE2-ben, 50 µg/mL kanamicint és 35 µg/mL klóramfenikolt tartalmazó LB táptalajon végeztük. A sejteket 0,35 mM IPTG-vel indukáltuk 0,85 OD600 elérése után, és a fehérjét 18 °C-on 18 órán keresztül fejeztük ki. A GyrB tisztítási eljárása a GyrA esetében fent leírtak szerint történt. 10 mg GyrB-t nyertünk 3 L tenyészetből.
Teljes DNS-giráz rekonstitúció
E. coli GyrA-t és GyrB-t ekvimoláris arányban kevertük, hogy lehetővé tegyük a teljes DNS-giráz rekonstitúciót. A komplexet tovább tisztítottuk Superdex S200 16/60 méretkizáró kromatográfiás oszlopon (GE Healthcare) krio-EM pufferrel (20 mM Hepes, 30 mM NaGlu, 30 mM KAc, 2 mM MgAc, 0,5 mM TCEP, pH 8,0) (1. ábra és Kiegészítő ábra. 1).
Nukleinsav-előkészítés
A Sigma-Aldrichtól beszerzett 2 foszforilált aszimmetrikus szintetikus oligonukleotid12 felhasználásával állítottunk elő egy kétszeresen bevarrt 180 bp-os DNS-duplexet (1. kiegészítő táblázat). Röviden, a nukleinsavakat DNS-mentes vízben oldottuk fel 1 mM koncentrációban. A kettős szálú DNS összeállításához az egyes oligokat 1:1 mólarányban kevertük, majd 95 °C-on 2 percig inkubálva, majd a hőmérsékletet 1 percenként 1 °C-kal csökkentve 20 °C-ig lágyítottuk. A lágyított, duplán bevágott DNS-duplexet ezután BioSpin 6 oszlopon (BioRad) 20 mM pH 8,0 Hepes pufferrel kicseréltük.
Komplexképzés a krio-EM-hez
A tisztított DNS-girázt 1:1 mólarányban kevertük a 180 bp dsDNS-sel, a fehérje és a DNS végső koncentrációja 32 µM volt. Az elegyet 10 percig inkubáltuk 37 °C-on. A 100%-os DMSO-ban 10 mM-ban reszuszpendált gepotidacint (GSK2140944, a MedChemExpressnél vásárolt) hozzáadtuk, hogy elérjük a 170 µM-os végső koncentrációt (1,7% DMSO). Az elegyet 10 percig inkubáltuk 37 °C-on. A komplexhez 340 µM végső koncentrációban AMP-PNP-t (Sigma) adtunk. A teljesen rekonstituált komplexet további 30 percig inkubáltuk 30 °C-on. Végül 8 mM CHAPSO-t (Sigma-Aldrich) adtunk a komplexhez. A mintát 2 órán át 16 000 × g-n centrifugáltuk az esetleges aggregátumok eltávolítása érdekében.
Cryo-EM rács előkészítése
A 300 mesh-es Quantifoil R-1.2/1.3 rézrácsokat 20 másodpercig izzítottuk, mielőtt 4 µl komplexet felhordtunk. A rácsokat 30 másodperces inkubáció után a Vitrobot mark IV (FEI) segítségével, 10 °C-on, 95%-os kamrai páratartalom mellett, folyékony etánba merítettük.
Elektronmikroszkópia
A krio-EM képalkotást 300 kV-on működtetett Titan Krios mikroszkópon (FEI) végeztük, amely egy K2 Summit direkt elektronkamerával (Gatan), egy 20 e-V résszélességű, nulla energiaveszteségű üzemmódban működő GIF Quantum energiaszűrővel (Gatan), egy Volta fázislemezzel (FEI) és egy CS korrektorral (FEI) volt felszerelve. A képeket EFTEM nanoszondás üzemmódban vettük fel Serial EM53 szuperfelbontású számláló üzemmódban 130 000x névleges nagyítással, 0,44 Å szuperfelbontású pixelmérettel és állandó -500 nm-es defókuszcéllal (2c. kiegészítő ábra). A VPP-t 100 percenként új pozícióba léptettük előre (2b. kiegészítő ábra). Négy adatsort gyűjtöttünk a detektoron 6-8 e-/pixel/s dózisteljesítmény mellett (0,88 Å pixelméret a mintán). A képeket 50 e-/Å2 összdózissal, 7-10 s közötti expozíciós idővel és 0,2-0,25 s-os alképekkel (összesen 35-50 képkocka) rögzítették. A 4 adatkészlet adatgyűjtése után összesen 11 833 filmet rögzítettünk.
Adatfeldolgozás
Az egyes adatkészletek adatfeldolgozása külön-külön, ugyanazt az eljárást követve történt, egészen a 3D finomításokig, amikor a részecskéket egyesítettük. A szuperfelbontású, dózisfrakcionált részképeket IMOD54 segítségével erősítéskorrigáltuk, kétszer Fourier-croppinggel binneltük, driftkorrigáltuk és MotionCor255 segítségével dózissúlyoztuk, így kaptuk a 0,88 Å pixelméretű összesített képeket. A korrigált mikrofelvételek kontrasztátviteli függvényét a GCTF v1.0656 segítségével becsültük meg. A Thon-gyűrűket kézzel ellenőriztük asztigmatizmus szempontjából, és a 4 Å-nál rosszabb felbontású mikrofelvételeket elvetettük, így 8 701 mikrofelvétel maradt meg. A részecskék automatikus kiválasztása a RELION229,30 referencia nélküli Gauss-féle blob picking protokolljával történt. A 4 adatkészletet együttvéve összesen 1 572 962 részecskét választottunk ki. Az egyes adatkészletekből négyszer binnelt részecskéket külön-külön két körös 2D osztályozásnak vetettük alá a RELION2-ben, hogy eltávolítsuk a szemét részecskéket és a szennyeződéseket, így összesen 479 667 részecskét kaptunk a további feldolgozáshoz. A négy adatkészlet részecskéit egyetlen egyedi adatkészletté egyesítettük, majd 3 × 3 binnelt formátumban újbóli extrahálást végeztünk központosítással. Ezután a 2D osztályozás utolsó fordulóját végeztük el, ami egy 338 616 részecskéből álló végső részecskehalmazt eredményezett. Az ezt követő részecskehalmazt egy kör 3D ab-initio osztályozásnak vetettük alá a cryoSPARC31 rendszerben. A rossz minőségű modellek elvetése után a megmaradt ab-initio modell 191 456 részecskéből álló végső adathalmazt eredményezett, 0,9-es osztályvalószínűségi küszöbértékkel (2a. kiegészítő ábra). Az ab-initio modellt aluláteresztő szűréssel 30 Å-ra szűrtük, és referenciaként használtuk a cryoSPARC-ban végzett homogén finomításhoz, ami egy 5,4 Å-s térképet eredményezett. A finomított részecskekoordinátákat ezután a GCTF v1.06 segítségével helyi CTF becsléshez használtuk, amelyet a 2 × 2 binnelt részecskék központozással történő újbóli extrakciója követett. Ezt az új részecskehalmazt 3D automatikus finomításnak vetettük alá a RELION2-ben a 30 Å-nál aluláteresztett ab-initio modell segítségével, ami egy 5,0 Å globális felbontású térképet eredményezett (3. kiegészítő ábra). A lokális felbontás 4,0 Å-tól a DNS-kötő/törő magban 9,0 Å-ig terjedő felbontást mutatott az ATPáz doménben és a DNS-t beburkoló GyrA β-kerékben, ami e két modul nagyfokú rugalmasságára utal. Ahhoz, hogy a teljes komplex végleges rekonstrukcióját megkapjuk az egyes domének jól meghatározott sűrűségével, 3D osztályozást végeztünk igazítás nélkül, amely több különböző osztályt eredményezett. Három osztály részecskéit egyesítettük (94 633 részecske). Az ezt követő 1 × 1-binnelt részecskehalmazt a RELION2-ben maszk nélkül finomítottuk a késői finomítási iterációkig, ahol a felbontás javítása érdekében puha maszkot alkalmaztunk. A térkép utólagos feldolgozása a teljes komplex 6,6 Å felbontású rekonstrukcióját eredményezte (3. kiegészítő ábra).
A különböző helyi megközelítések kombinációját használtuk a különböző konformációk azonosítására és az egyes tartományok helyi felbontásának javítására. Mivel az ATPáz domén túl kicsi volt a 3D fókuszált finomításhoz, először az ATPáz domén fókuszált 3D osztályozását végeztük el puha maszkkal és igazítás nélkül a RELION2-ben. Kiválasztottunk egy 58 329 részecskéből álló, az ATPáz-domén jól meghatározott sűrűségű osztályát, majd az 1 × 1-binnelt részecskék újbóli extrakcióját követően 0,88 Å/pixel pixelméretű részecskéket kaptunk. A részecskék pontos igazításának megkönnyítése érdekében ezt az osztályt tovább finomítottuk a RELION2-ben az ATPáz-domén és a DNS-kötő/tisztító domén körüli puha maszk segítségével, ami egy 5,9 Å globális felbontású térképet eredményezett (ATPáz-mag) (3. kiegészítő ábra).
Második lépésként a GyrA β-tűkerék fókuszált 3D osztályozását végeztük el puha maszkkal és igazítás nélkül a RELION2-ben. Kiválasztottunk egy 45 040 részecskéből álló osztályt a GyrA β-tűkerék jól meghatározott sűrűségével, majd az 1 × 1-binnelt részecskék újbóli extrakcióját követően 0,88 Å/pixel pixelméretű részecskéket kaptunk. Ezt az osztályt a RELION2-ben tovább finomítottuk a β-tűkerék és a DNS-kötő/tisztító domén körüli puha maszk használatával, ami egy 6,3 Å felbontású térképet eredményezett (CTD-Core) (3. kiegészítő ábra).
Végezetül a RELION2-ben fókuszált 3D automatikus finomítást végeztünk a DNS-kötő/tisztító domén körüli puha maszk használatával. A térkép utólagos feldolgozása a DNS-kötő/tisztító domén 4,3 Å felbontású rekonstrukcióját eredményezte. Ezután a DNS-kötő/tisztító domén fókuszált 3D osztályozását végeztük el. Az osztályok közül kettő jobb szögpontosságot és a DNS-kötő/tisztító domén zárt (60 548 részecske) és megnyílás előtti (53 655 részecske) konformációit különböztette meg. Ezt a két osztályt tovább finomítottuk a RELION2-ben C2 szimmetriájú fókuszált 3D finomítással, 1 × 1 binnelt részecskékkel, és az utófeldolgozás után 4,0, illetve 4,6 Å globális felbontású rekonstrukciókat adtak (3. kiegészítő ábra). A zárt DNS-kötő/tisztító tartományt tovább finomítottuk fókuszált 3D finomítással, puha maszkot használva, amely kizárja a rendezetlen TOPRIM-beillesztést, így egy 4,0 Å-s, jó minőségű térképet kaptunk (3. kiegészítő ábra).
Minden közölt felbontás az arany standard FSC-0,143 kritériumon57 alapul, és az FSC-görbéket a RELION2-ben, valamint a cryoSPARC-ban nagy felbontású zajszubsztitúció58 segítségével korrigáltuk a lágy maszk konvolúciós hatásaira (4a. kiegészítő ábra). Minden rekonstrukciót egy negatív B-tényező alkalmazásával élesítettünk, amelyet automatizált eljárásokkal becsültünk59. A térképek helyi felbontását a Blocres60 segítségével számoltuk ki (4c. kiegészítő ábra). A teljes komplex, az ATPáz-mag, a CTD-mag és a DNS-kötő/törő domén krio-EM térképeit zárt (TOPRIM-beillesztéssel és anélkül), valamint a megnyitás előtti állapotban az EM Data Bankban EMD-4913, EMD-4914, EMD-4915, EMD-4910, EMD-4909, EMD-4912 hozzáférési számok alatt helyeztük el.
Modellépítés és finomítás
A TOPRIM inszerciót nem tartalmazó DNS-kötő/törő domén 4,0 Å-nál megoldott EM-rekonstrukciója volt a legjobb minőségű. Szinte minden oldallánc látható volt, és a gepotidacin sűrűsége is jól látható volt. Ezt a térképet az E. coli DNS-giráz DNS-kötő/törő doménjének kristályszerkezetének finomítására használták17. A DNS-kötő/törő domén dimer atomos modelljét a PDB 3NUH segítségével generáltuk PyMol (Schrodinger L.L.C.) programban. Az ezt követő atommodellből eltávolítottuk a TOPRIM-beillesztéshez tartozó aminosavakat, az összes iont és vízmolekulát, minden foglaltságot 1-re, a B-faktorokat pedig 50-re állítottuk. Először az atommodellt a Chimera61 segítségével merevtest-illesztettük a szűrt és élesített térképre. A PHENIX62 programban a valós térbeli finomítás első körét helyi valós térbeli illesztéssel és globális gradiensvezérelt minimalizációs finomítással végeztük el. Ezután a S. aureus DNS-giráz41 (PDB 5IWM) szerkezetéből 20 nukleinsavat másoltunk és illesztettünk be az atomi modellünkbe. A DNS-szekvenciát a szerkezetünkben használt DNS-nek megfelelően módosítottuk. A hiányzó fehérjemaradványokat és nukleinsavakat kézzel építettük be a COOT63-ban. A gepotidacin (GSK-2140944) atommodelljét és kényszerszótárát a Grade szerverrel (http://grade.globalphasing.org) generáltuk. A gepotidacint ezután a COOT-ban kézzel illesztettük az üres elektronsűrűségbe, majd duplikáltuk. Mindkét duplikátumot 0,5 foglaltságra állítottuk be. A PHENIX-ben több körös valós térbeli finomítást végeztünk a másodlagos szerkezet, a rotamerek, a Ramachandran és a nem kristályos szimmetria korlátozásaival, amelyet mindig kézi ellenőrzés követett a COOT-ban, amíg egy konvergáló modellt nem kaptunk. Végül a B-tényezőket a PHENIX-ben egy utolsó körös valós térbeli finomítással finomítottuk a korábbiakkal megegyező beállítások alkalmazásával. A finomítás konvergálása után a TOPRIM beillesztés atomkoordinátáit hozzáadtuk az atommodellhez. Ezt tovább finomítottuk az EM-rekonstrukciókban, amelyek a zárt és a nyitott állapot előtti beillesztési sűrűséget tartalmazzák, ugyanezzel az eljárással. Féltérképes keresztvalidálást végeztünk, hogy meghatározzuk az 1,5-ös értéket, mint a legjobb finomítási súlyt a PHENIX-ben, amely lehetővé teszi az atomütközések csökkentését és a modell túlillesztésének megelőzését (4e. kiegészítő ábra). Minden finomítási lépést a rekonstrukciók felbontási határértékének felhasználásával végeztünk az arany standard FSC-0.143 kritériumnak57 megfelelően. A finomítási paramétereket, a modellstatisztikákat és a validálási pontszámokat a 2. kiegészítő táblázat foglalja össze. Az E. coli DNS-kötő/törő domén zárt (beillesztéssel és anélkül) és megnyitás előtti konformációban lévő atommodelleit a Protein Data Bankban helyeztük el 6RKU, 6RKS, 6RKV hozzáférési számok alatt.
A teljes komplexhez különböző EM-rekonstrukciók kombinációját használtuk a DNS-giráz teljes komplex atommodelljének létrehozásához. Az 5,9 Å-n megoldott ATPáz-mag szerkezetet használtuk az ATPáz-domén ADPNP32-vel (PDB 1EI1) komplexben lévő kristályszerkezetének és a zárt konformációban finomított DNS-kötő/törő doménnek a Chimera-ban történő merevtest-illesztéséhez. Az elektronsűrűség minősége lehetővé tette, hogy a COOT-ban felépítsük az ATPáz-domén és a DNS-kötő/tisztító domén közötti linker hiányzó maradványait. A 6,3 Å-nál megoldott CTD-Core szerkezetet használtuk a β-tűkerék kristályszerkezet10 pontos merevtest-illesztésére a Chimera programban. A GyrA-boxot követő 10 hiányzó aminosavat (564-574) a Phyre264 modellező szerver segítségével adtuk hozzá. Az elektronikus sűrűség minősége lehetővé tette, hogy a COOT-ban felépítsük a β-tűkerék körüli hiányzó nukleinsavakat, valamint az utolsó GyrA-maradványokat a β-tűkerékhez kötő 10 aminosavat. A másodlagos szerkezet előrejelzése alapján a linker egy részét alfa-helixként építettük meg (3. ábra). Az ezt követő, az ATPáz domént, a DNS-kötő/törő domént és egy β-tűkereket tartalmazó atommodellt a Chimera segítségével 6,6 Å-nál megoldott teljes komplex szerkezetbe illesztettük be merevtest-illesztéssel. Ezután az első β-tűkerék egy példányát illesztettük a második β-tűkerék sűrűségére a COOT-ban. A második β-tűkerék körüli hiányzó nukleinsavakat, valamint a linker hiányzó 10 maradékát kézzel építettük be a COOT-ban. Az így kapott atommodellből eltávolítottuk az összes iont és vízmolekulát, az összes foglaltságot 1-re, a B-tényezőket pedig 50-re állítottuk. Végül az atommodell valós térbeli finomítását a teljes komplex szerkezethez képest a PHENIX-ben végeztük el, merevtest- és globális gradiens-vezérelt minimalizációs finomítással. A finomítás felbontási határát az arany standard FSC-0.143 kritérium57 szerint határoztuk meg. Féltérképes keresztvalidálásokat is végeztünk (4e. kiegészítő ábra). A finomítási paramétereket, a modellstatisztikákat és a validálási pontszámokat a 2. kiegészítő táblázat foglalja össze. A teljes szerkezet atommodelljét a Protein Data Bankban helyeztük el a 6RKW hozzáférési szám alatt. Minden ábrát Chimera61, ChimeraX65 és PyMol (Schrodinger L.L.C.) segítségével készítettünk.
E. coli GyrB R286K, R286Q és E264A tisztítás
A vad típusú E. coli GyrB R286K, R286Q és E264A tisztításhoz használt módosított pET28b
A vad típusú E. coli GyrB overexpressziójához használt PETB-t helyirányított mutagenezissel mutáltuk a QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) segítségével, hogy három R286K, R286Q vagy E264A mutációt hordozó plazmidot hozzunk létre (4. kiegészítő táblázat). A három mutáns overexpressziós és tisztítási eljárása megegyezik a vad típusú GyrB-vel, amelyet fentebb a Módszerek részben ismertettünk.
T. thermophilus GyrB K284R, K284Q tisztítás
A vad típusú T. thermophilus GyrB K284R, K284Q tisztításhoz használt módosított pET28b-t
A vad típusú T. thermophilus GyrB overexpressziójához12 használt PETB-t helyirányított mutagenezissel mutáltuk a QuikChange XL Site-Directed Mutagenesis kit (Agilent) segítségével, hogy két K284R vagy K284Q mutációt hordozó plazmidot hozzunk létre (4. kiegészítő táblázat). A két mutáns overexpressziós és tisztítási eljárásai megegyeznek a fent a Módszerek részben leírt vad típusú E. coli GyrB-vel.
DNS szupercoiling assay
A DNS-giráz (GyrA2B2) növekvő koncentrációját 37 °C-on inkubáltuk 6 nM lazított pUC19 plazmiddal 20 mM Tris-acetát pH 7,9, 100 mM kálium-acetát, 10 mM magnézium-acetát, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 100 µg/ml BSA-t tartalmazó reakcióelegyben. 30 perc elteltével a reakciókat 1%-os SDS hozzáadásával állítottuk le. Agaróz gélelektroforézissel követtük nyomon a relaxált pUC19 átalakulását a szupertekercselt formába. A mintákat 0,8%-os agaróz, 1X Tris Borate EDTA puffer (TBE) gélen futtattuk 6 V/cm-en 180 percig szobahőmérsékleten. Az agaróz géleket 0,5 mg/ml etídium-bromiddal festettük 1X TBE-ben 15 percig, majd 5 percig vízben festettük. A DNS topoizomereket Typhoon (GE Healthcare) segítségével mutattuk ki.
ATPáz aktivitás vizsgálata
AzATP hidrolízis mérése a NADH piruvát kináz (PK) és laktát dehidrogenáz (LDH) által közvetített oxidációjának követésével történik. Az abszorbanciát 340 nm-en figyeltük 600 s alatt 37 °C-on Shimadzu 1700 spektrofotométerrel. A reakciókat három példányban vettük fel 50-100 nM GyrA2B2-vel és 16 nM lineáris DNS-sel (pCR-blunt) 500 µl pufferben, amely 50 mM Tris HCl pH 7,5, 150 mM kálium-acetát, 8 mM magnézium-acetát, 7 mM BME, 100 µg/mg BSA, 4U/5U PK/LDH keverék, 2 mM PEP, és 0 .2 mM NADH.
Multiple alignment and evolutionary conservation of residues
GyrB ATPase/Transducer protein sequences from 30 species (Uniprot codes: GYRB_STRCO, Streptomyces coelicolor; A0A3A2T2C3_LISMN, Listeria monocytogenes; W8F4Q2_AGRT4, Agrobacterium tumefasciens; Q83FD5_COXBU, Coxiella burnetii; GYRB_ECOLI, Escherichia coli; GYRB_NEIGO, Neisseria gonorrhoeae; GYRB_SALTY, Salmonella typhimurium; Q7V9N3_PROMA, Prochlorococcus marinus; GYRB_STRR6, Streptococcus pneumoniae; GYRB_MYCPN, Mycoplasma pneumoniae; GYRB_SHIFL, Shigella flexneri; GYRB_PSEAE, Pseudomonas aeruginosa; Q18C89_PEPD6, Clostridium difficile; GYRB_RICFE, Rickettsia felis; Q8CZG1_YERPE, Yersinia pestis; GYRB_BORBU; Borrelia burgdorferi; GYRB_ENTFA, Enterococcus faecalis; Q8YEQ5_BRUME, Brucella melitensis; GYRB_STAAU, Staphylococcus aureus; Q7VQU8_BLOFL, Blochmannia floridanus; GYRB_HAEIN, Haemophilus influenzae; GYRB_MYCTU, Mycobacterium tuberculosis, GYRB_THEMA, Thermotoga maritima; GYRB_THET8, Thermus thermophilus; GYRB_BACSU, Bacillus subtilis; GYRB_HELPY, Helicobacter pylori; GYRB_CHLTR, Chlamydia trachomatis; GYRB_VIBCH, Vibrio cholerae; GYRB_THEAQ, Thermus aquaticus; GYRB_AQUAE, Aquifex aeolicus) a Clustal Omega szerver (EMBL-EBI) segítségével igazították egymáshoz. Az ezt követő összehangolást arra használtuk, hogy a ConSurf szerver (http://consurf.tau.ac.il) segítségével ábrázoljuk az aminosavak evolúciós konzerváltságát az ATP-bázis/transzducer szerkezetén (PDB ID 1EI1). A filogenetikai fát a Clustal Omega programban végzett többszörös illesztés felhasználásával, neighbour-joining módszerrel hoztuk létre.
Reporting summary
A kutatási tervvel kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.