Alanyok
Ez a vizsgálat 88 kezelést nem igénylő, távoli metasztázis nélküli LC-beteget vizsgált. Valamennyi beteget gége laphámsejtes karcinómával diagnosztizálták a minták patológiai vizsgálata alapján, és a Ryukyus Egyetem Fül-orr-gégészeti, Fej- és Nyaksebészeti Osztályán kezelték őket 2008 januárja és 2017 decembere között. A betegek végleges prognózisát 2018 júliusában ítélték meg. A tumor, csomópont, metasztázis (TNM) stádium besorolását az AJCC Staging Manual (7. kiadás) szerint végeztük. A klinikai stádium meghatározásához és az egyidejűleg fennálló többszörös primer rákos megbetegedések felderítéséhez a betegeknél a felső tápcsatorna fizikai és endoszkópos vizsgálatát, a nyak ultrahangos vizsgálatát, komputertomográfiát (CT) és 18F-fluorodeoxiglükóz-pozitronemissziós tomográfiás CT-képalkotást végeztek.
A vizsgálatot a Ryukyus Egyetem Intézeti Felügyelő Bizottsága hagyta jóvá, és a 2008-ban módosított 1975-ös Helsinki Nyilatkozatnak megfelelően végezték. Minden LC betegtől tájékozott beleegyezést kaptunk a felvétel előtt.
Kezelés
A fő kezelés a primer lézió gyógyító szándékú kezelése volt T1-ben kizárólag hagyományos sugárkezelés (RT) vagy lézeres rezekció, T2-ben egyidejű kemoradioterápia (CCRT), T3-ban CCRT vagy műtét, T4-ben pedig műtét, függetlenül a HPV jelenlététől. A csomós elváltozásokat CCRT-vel vagy az elsődleges elváltozás reszekciójával kombinált nyaki disszekcióval kezelték. Minden betegnél, aki RT-ben részesült (teljes dózis, 70 Gy), CT-alapú háromdimenziós sugárkezelés-tervezés történt a kezelési pozícióban, maszkos immobilizációval. A CCRT protokollja a korábban közöltek szerint történt. Ha a T3-as primer tumor nem mutatott részleges választ, függetlenül a nyaki nyirokcsomó válaszától 39,6 Gy besugárzás mellett, a betegek nyaki disszekcióval kombinált kuratív műtétet végeztek a primer lézión.
A HPV-státusz kimutatása és p16 immunhisztokémia
A sugárkezelés vagy kemoterápia nélküli primer léziókból származó összes szövetmintát polimeráz láncreakcióval (PCR) elemeztük HPV DNS kimutatására a friss fagyasztott mintákból, amelyeket biopszia vagy sebészi reszekció során nyertünk, és p16 immunhisztokémiával az FFPE mintákból. A PCR negatív HPV-kimutatási eredménnyel és p16-túlrepresszióval (≥75% pozitív sejtek és legalább mérsékelt festődési intenzitás) rendelkező eseteket HPV-státusz szempontjából tovább értékeltük HPV-DNS-szondákkal végzett in situ hibridizáció (ISH) segítségével (DNS-ISH) . A HPV-16-ot hordozó esetekben kvantitatív valós idejű PCR-t (qPCR) végeztünk a vírusterhelés és a fizikai státusz meghatározására az alábbiakban leírtak szerint .
PCR a HPV DNS kimutatására
Röviden, a DNS-t a daganatmintákból Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD) segítségével izoláltuk. A DNS jelenlétét és integritását minden mintában PCR β-globin gén amplifikációval ellenőriztük a PC04 és GH20 primerek használatával. A GP5+/GP6+ és MY09/MY11 általános konszenzus primer készleteket használtuk a HPV DNS jelenlétének PCR segítségével történő elemzésére (1. táblázat) a korábban leírtak szerint. Ezenkívül a GP5+/GP6+ vagy MY09/MY11 PCR-re negatív DNS-mintákat a GP5+/GP6+ primerpárral történő nested PCR megközelítéssel újraamplikáltuk. A várt méretű PCR-termékeket (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) megtisztítottuk és közvetlenül szekvenáltuk ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzerrel (Applied Biosystems, Foster City, CA). A szekvenciákat a BLAST program segítségével igazítottuk egymáshoz és hasonlítottuk össze a GenBank adatbázisban található ismert HPV típusok szekvenciáival.
p16 immunhisztokémia
A p16 immunhisztokémiáját a CINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Németország) segítségével végeztük a gyártó protokolljának megfelelően . Az immunjelölést 3,3′-diaminobenzidinben történő inkubálással tettük láthatóvá, és a festett tárgylemezeket hematoxilinnel ellenfestettük.
A jelen vizsgálatban használt p16 immunreaktivitás pontozási kritériumai a következők voltak: 0, nincs festődés; 1, a tumorsejtek 1 – < 25%-a pozitív a p16-ra; 2, 25 – < 50% pozitív; 3, 50 – < 75% pozitív; 4, ≥75% pozitív és gyenge festődési intenzitás; és 5, ≥75% pozitív és legalább közepes festődési intenzitás. A “p16 overexpresszió” (p16-pozitív) kifejezést jelen vizsgálatban 5-ös pontszámmal definiáltuk.
ISH HPV DNS-szondákkal
A biotinil-tiramid alapú ISH-t a GenPoint™ HPV biotinilált DNS-szondával és a GenPoint tiramid jelerősítő rendszerrel végeztük biotinilált szondákhoz a gyártó protokolljának megfelelően (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). A GenPoint HPV biotinilált DNS-szonda a 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 és 68 HPV-típusokkal reagál FFPE minták 4μm vastagságú metszeteiben. A hibridizált szonda kimutatását a GenPoint detektáló rendszerrel végeztük a gyártó protokollja szerint, a benne lévő elsődleges sztreptavidin-tormaperoxidáz (HRP), biotinil-tiramid, másodlagos sztreptavidin-HRP és 3,3′-diaminobenzidin l (Dako; Agilent Technologies) segítségével. A tárgylemezeket hematoxilinnel ellenfestettük.
A HPV-16 vírusterhelésének és fizikai státuszának becslése qPCR segítségével
A HPV-16 vírusterhelésének és fizikai státuszának értékeléséhez qPCR-t végeztünk a korábban leírtak szerint . Röviden, a HPV-16 E2 és E6 nyílt olvasókereteket célzó primereket és TaqMan szondákat használtunk (1. táblázat). A primerek és a szondák az E2 csuklós régiót ismerik fel, amely a HPV-16 integrációja során törlődik. Az E2 és E6 génekre két standard görbét hoztunk létre a pB-actin korai plazmid 10-szeres sorozatos hígításainak (101, 102, 103, 104, 105 és 106 víruskópiák) amplifikálásával, amely Karl Munger ajándéka volt, és a teljes HPV-16 korai gén régiót hordozza (Addgene plazmid # 13711; Addgene, Cambridge, MA). A vírusos DNS-terhelést az E6 kópiaszám kiszámításával értékeltük. A sejtes DNS mennyiségi meghatározásához külső standard görbét készítettünk humán genomiális placentáris DNS (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Németország) ismert sorozatos hígításai (0,3, 3, 30 és 300 ng) felhasználásával, a β-globint pedig a korábban leírt módon amplifikáltuk. A DNS mennyiségét a Cq-értékek és a standard görbe logaritmusának ábrázolásával számoltuk ki. A HPV-16 fizikai státuszát egy korábban közzétett módszer alapján értékeltük . Az E2/E6 arány ≥ 1 az epizomális forma túlsúlyát jelzi, míg az E2 kópiaszám/teljes E6 arány < 1 az integrált és epizomális forma (kevert forma) jelenlétét jelzi.
E6 mRNS expresszió kimutatása qPCR és RNS ISH segítségével p16 overexpresszióval rendelkező HPV-16-pozitív betegeknél
E6 mRNS expressziót mutattunk ki a p16 overexpresszióval rendelkező HPV-16-pozitívként azonosított betegek mintáiban. A teljes RNS-t fagyasztott szövetekből RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japán) segítségével extraháltuk a gyártó utasításainak megfelelően. A teljes RNS-t (500 ng) első szálú cDNS szintézisére használtuk a PrimeScript™ RT Reagent Kit gDNA Eraserrel (Perfect Real Time; Takara Bio) segítségével, a gyártó utasításainak megfelelően. A HPV-16 E6 mRNS expressziójának méréséhez qPCR-t végeztünk a CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) és TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA) segítségével. A HPV-16 E6 gént és a β-aktin gént célzó primereket és TaqMan szondákat (1. táblázat) használtunk . A β-aktin szondát 5′ végén FAM-mal, 3′ végén pedig TAMRA-val jelölték (Applied Biosystems Japan, Tokió, Japán). Az amplifikációs feltételek a következők voltak: A kétlépéses ciklust 95 °C-on 15 másodpercig 95 °C-on és 60 °C-on 60 másodpercig 60 °C-on végeztük, összesen 40 ciklust. Két standard görbét készítettünk az E6 és a β-aktin génekre a pB-aktin korai plazmid és a pCAG-mGFP-aktin plazmid, amely Ryohei Yasuda ajándéka volt, és amely a β-aktin teljes kódoló régióját hordozza (Addgene plazmid # 21948; Addgene), sorozatos 10-szeres hígítások (101, 102, 103, 104, 105 és 106 példány) amplifikálásával. Az E6 gén expresszióját minden egyes mintában a belső kontroll β-aktin mennyiségével normalizáltuk.
A HPV-16/- 18 E6/E7 mRNS ISH vizsgálatát RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) segítségével végeztük a gyártó utasításai szerint. Röviden, az FFPE minták 4 μm vastagságú sorozatos metszeteit xilolban deparaffinizáltuk, majd fokozatos alkoholsorozat segítségével rehidratáltuk. Az endogén peroxidázt az RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagenssel szobahőmérsékleten 10 percig blokkoltuk. A cél HPV RNS visszanyerését RNAscope® Target Retrieval Reagensben végeztük 100 °C-on 15 percig. A tárgylemezeket RNAscope® Protease Plus-szal emésztettük 40 °C-on 30 percig. A HPV-16/- 18 E6/E7 RNS-szondát (RNAscope® Probe-HPV16/18) adtuk a metszetekhez, majd fedőlemezt helyeztünk rá. A tárgylemezeket párásított kamrába helyeztük át a hibridizációhoz 40 °C-on 2 órán keresztül. Ezután a fedőlemezeket eltávolítottuk, és a tárgylemezeket 40 °C-on RNAscope® Wash Buffer Reagenssel mostuk. A jelerősítést a gyártó utasításai szerint végeztük. A hibridizált szonda kimutatását 3,3′-diaminobenzidin (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit) használatával végeztük. A tárgylemezeket hematoxilinnel ellenfestettük. Az RNS ISH-ba pozitív kontroll tárgylemezeket (HPV-18 E6/E7 mRNS-t expresszáló HeLa sejtek) vontunk be. A pozitív festődést a sejtmagban és/vagy a citoplazmában látható barna pontszerű pontokként azonosítottuk.
Statisztikai elemzés
Pearson khi-négyzet tesztet használtunk az LC betegek jellemzőinek összehasonlítására a HPV DNS és a p16 overexpressziós státusz szerint. A kumulatív túlélést (CS) a Kaplan-Meier-módszerrel számoltuk ki, és a két csoport között a log-rank teszt segítségével hasonlítottuk össze. Minden elemzést az SPSS statisztikai csomaggal végeztünk (SPSS, 25.0 verzió; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). A P < 0,05 szignifikánsnak minősült.