APL 1998 óta kínál natív gélelemzési szolgáltatásokat. Manapság sajnos sok laboratórium figyelmen kívül hagyja ezt az értékes eszközt, mert úgy gondolják, hogy a natív gélek egyszerűen túl nehezen használhatóak, vagy mert tévesen azt hiszik, hogy csak savas fehérjékkel használhatók. Az Alliance Protein Laboratories-nál rutinszerűen futtatunk natív géleket bázikus és savas fehérjékkel egyaránt. Szívesen futtatunk mintákat Önnek és/vagy együttműködünk Önnel a laboratóriumában használható protokoll kidolgozásában.
Mi az a natív gél?
A “natív” vagy “nem denaturáló” gélelektroforézis SDS hiányában történik. Míg SDS-PAGE esetén a fehérjék elektroforetikus mozgékonysága elsősorban a molekulatömegtől függ, addig a natív PAGE esetén a mozgékonyság a fehérje töltésétől és hidrodinamikai méretétől is függ.
Az elektroforézist mozgató elektromos töltést a fehérje belső töltése határozza meg a futtató puffer pH-jánál. Ez a töltés természetesen függ a fehérje aminosav-összetételétől, valamint a poszttranszlációs módosításoktól, mint például a szialinsavak hozzáadása.
Mivel a fehérje megtartja összehajtott konformációját, hidrodinamikai mérete és mozgékonysága a gélen szintén e konformáció jellegétől függ (nagyobb mozgékonyság a kompaktabb konformációk esetében, kisebb a nagyobb szerkezetek, például oligomerek esetében). Ha a natív PAGE-t semleges pH közelében végezzük, hogy elkerüljük a savas vagy lúgos denaturációt, akkor felhasználható a konformáció, az önasszociáció vagy aggregáció, valamint más fehérjék vagy vegyületek kötődésének vizsgálatára.
A natív gélek tehát érzékenyek lehetnek minden olyan folyamatra, amely megváltoztatja a fehérje töltését vagy konformációját. Ez teszi őket kiváló eszközzé olyan dolgok kimutatására, mint:
-
a töltés kémiai lebomlás miatti változásai (pl. deamidáció)
-
nem hajtogatott, “olvadt gömböc” vagy más módosított konformációk
-
oligomerek és aggregátumok (kovalens és nem kovalens)
-
kötési események (fehérje-fehérje vagy fehérje-ligand)
Ezek a tulajdonságok, és viszonylag nagy áteresztőképességük miatt a natív gélek kiváló eszközök a gyorsított stabilitású minták elemzésére, a különböző tételek vagy eljárások összehasonlíthatóságának bizonyítására vagy a segédanyagok hatásainak vizsgálatára.
A natív gélek másik előnye, hogy az elválasztás után a fehérjéket natív állapotukban lehet visszanyerni. Az aktív biológiai anyagok visszanyerését azonban bármilyen fixálás vagy festés előtt meg kell tenni.
Megjegyezzük, hogy az itt tárgyalt natív géleket most néha “tiszta natív” géleknek nevezik. Ezek elvileg különböznek az úgynevezett “kék natív” gélektől, amelyek a festék megkötésétől függnek, hogy a fehérje nagyon magas elektromos töltést kapjon, ami felülmúlja a polipeptid belső töltését. Ha feltételezzük, hogy a megkötött festék mennyisége arányos a fehérje tömegével, akkor az ilyen “kék natív” protokollal megfigyelt mobilitás felhasználható a moláris tömeg becslésére fehérje standardokkal való összehasonlítással, hasonlóan az SDS-PAGE-hez. Az itt tárgyalt valódi natív gélek esetében a kék natív gélekkel való használatra értékesített tömegszabványok nem használhatók a moláris tömegek becslésére.