KÖZLEMÉNY
A festék kizárás egyszerű és gyors technika a sejtek életképességének mérésére, de fennáll az a probléma, hogy az életképességet közvetve a sejtmembrán integritásából határozzák meg. Így lehetséges, hogy egy sejt életképessége (a növekedési vagy működési képességgel mérve) akkor is károsodott, ha a sejt membránjának integritása (legalábbis átmenetileg) megmaradt. Fordítva, a sejtmembrán integritása lehet abnormális, de a sejt képes lehet megjavítani magát, és teljesen életképessé válhat. Egy másik lehetséges probléma, hogy mivel a festékfelvételt szubjektíven értékelik, a sejtkárosodásra utaló kis mennyiségű festékfelvétel észrevétlen maradhat. Ebben a tekintetben a fluoreszcens festékkel fluoreszcens mikroszkóppal végzett festékkizárás rutinszerűen több nem életképes, festékfelvételt mutató sejtet pontoz, mint a trypan-kékkel transzmissziós mikroszkóppal végzett vizsgálatok.
A sejtéletképesség mérésének kifinomultabb módszere a festékkizárás meghatározása áramlási citometriával. Ez elvégezhető a tripan-kék használatával, mivel ez a fehérje fehérjékhez kötődik, majd olyan fluoreszcens jelet bocsát ki, amely áramlási citométerrel detektálható (660 nm-en, ha szarvasmarha-szérumalbuminhoz kötődik) (A tripan-kék áramlási citometriában történő felhasználásának részleteit lásd a 2. hivatkozásban). Alternatívaként a kizárás más fénykibocsátó festékekkel, például propídium-jodiddal is mérhető (a sejtek életképességének áramlási citometriás elemzéssel történő értékelését a proprídium-jodid alkalmazásáról lásd az 5.4. egységben). Az élő vs. elhalt sejtek becslésének részletes összehasonlítása a trypan-kék kizárással történő kézi értékeléssel az itt leírtak szerint és az áramlási citometriával történő elektronikus értékeléssel azt mutatja, hogy a két technika tapasztalt kezekben nagyon hasonló eredményeket ad. Míg a leírt festékkizárásos technika a kezelő szubjektivitása miatt nagyobb valószínűséggel vezet hibához, az áramlási citometriai megközelítés kevésbé alkalmas a sejtek életképességének értékelésére összetett és időigényes sejttisztítási technikák végrehajtása során. Így az áramlási citometriai technika csak akkor alkalmazható, ha pontos méréseket kell végezni a sejtkeverékben lévő elhalt sejtek számáról.
A közelmúltban beszámoltak egy “automatizált fluoreszcens mikroszkópos életképességi vizsgálatról”, amelyben a sejtek életképességét propidium-jodidot használnak egy olyan eszközzel együtt, amely egy mikrochippel felszerelt hordozható mikroszkópos sejtszámlálóban élő és elhalt sejteket számol. Ez a számláló állítólag gyorsabban képes a sejtek életképességének értékelésére, mint az itt leírt kézi technika vagy az áramlási citométer, és pontosabb és megbízhatóbb számlálást tesz lehetővé. Ez a készülék hasznos lehet olyan helyzetekben, amikor a sejtek életképességének sok, gyorsan megszerzett vizsgálatára van szükség (3).
Megjegyzendő, hogy a sejtek életképessége DNS-hez kötődő festékekkel (etídium-monoazid), foszfatidil-szerinhez kötődő szerekkel (Annexin V) és amin-reaktív festékekkel is értékelhető. Ezeknek az alternatív szereknek a használata általában áramlási citometriát igényel, és ezért csak különleges körülmények között alkalmazható.
A fenti protokollban leírt tripan-kék kizárás 5-10 perc alatt elvégezhető.