PMC

Az eset bemutatása

A jelen esetjelentés egy 155 állatot tartó, két juhfajt (Pelifolk és Blackbelly) tartó farm rutinszerű állatorvosi látogatásából származik, amely a mexikói Jalisco állam Zapopan településén, Tesistánban található. Ennek a gazdaságnak a létesítményeit egy korábbi sertéstenyésztő gazdaságból alakították át, és a közeli szomszédságban még mindig sertés- és szarvasmarhatelepek veszik körül. Az állományt a tisztítás és a kezelés megkönnyítése érdekében magasított padlón tartották, azonban a karámokban számos sült, éles tárgy (például drót, törött kerítés, szögek stb.) volt jelen, és a farmon a tisztítást a vizsgálat idején nem végezték megfelelően. A takarmányozás a helyben rendelkezésre álló takarmányokon alapult, mint például: gyenge minőségű durva takarmány, sertéstrágya-szilázs és magas fehérjetartalmú kereskedelmi takarmánykoncentrátum. Ez a gazdaság azért hívta fel az állatorvosi szolgálatot, mert az állatoknál gyakran találtak bőr tályogokat, más, bőrproblémákkal kapcsolatos panaszról nem számoltak be. Úgy tűnt, hogy a tályogok nem befolyásolják az állatok termelékenységét, azonban az ilyen elváltozások jelenléte negatívan befolyásolja az állatok értékesítését, ezért a tulajdonos érdeklődött az etiológiai kórokozó és a betegségnek a gazdaságban való megszüntetésére ajánlott kezelés iránt. A tályogok tartalmából 31 állatból (29 anyajuh, 1 kos és 1 bárány) vett mintát egy okleveles állatorvos, és azt bakteriológiai diagnózis céljából laboratóriumba küldte, hogy megtalálják a problémát okozó etiológiai kórokozókat. A tályogok megjelenése alapján a fertőzés feltételezett diagnózisa a gazdaságban a legtöbb állat esetében Caseous lymphadenitis volt . A bakteriológiai elemzés azonban kimutatta, hogy 13 állat C. pseudotuberculosis, 1 Corynebacterium spp., 2 Proteus spp. és 2 Streptococcus spp. fertőzést mutatott ki, a fennmaradó 13 esetben pedig a kórokozót nem lehetett azonosítani. A Corynebacterium spp. izolátum kategorizálása nem volt egyértelmű, mivel a bakteriológiai és biokémiai vizsgálatok eredményei nem voltak lezáróak.

Ez a cikk a C. xerosis izolálását írja le egy 4 hónapos, jó fizikai állapotban lévő Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) bárányból. Legjobb tudomásunk szerint ez az első jelentés arról, hogy a C. xerosis klinikai bőr-tályogot okoz juhban. Az állat tulajdonosától tájékozott beleegyezést kaptunk a klinikai vizsgálat eredményeinek közzétételéhez, beleértve a fényképes anyagot is. Az állatnál a nyak bal oldalán kemény konzisztenciájú, vízelvezetés nélküli tályog alakult ki (1a. ábra). A kezdeti klinikai diagnózis eseti nyirokcsomó-gyulladásra utalt, amelyet valószínűleg C. pseudotuberculosis okozott. A bakteriológiai elemzéshez a tályog felületének megtisztítása és fertőtlenítése után a tályogot steril, 5 ml-es fecskendővel, 20-as injekciós tűvel szúrták át. A kinyert váladék típusa savószerű és fehér megjelenésű volt. A biológiai mintát 4 °C-on tárolták a Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, 15,5 km Toluca-Atlacomulco út, Toluca, Mexikó, 50200 z.c.) biológiai jellemzéséig. A mintavétel és a feldolgozás közötti idő nem haladta meg a 72 órát. A mintát két példányban tenyésztették 8 %-os juhvér agarban, és 24-48 órán át 37 °C-on, aerob és mikroaerofil körülmények között inkubálták. 1,0 mm átmérőjű, nem hemolitikus, sárgásbarna színű és kissé száraz megjelenésű kolóniákat figyeltünk meg (2a. ábra). Ezek a morfológiai jellemzők nem feleltek meg a C. pseudotuberculosisra korábban leírtaknak, hanem inkább a C. xerosis kolóniáinak tűntek . Mikroszkóposan (10×-es nagyítás; 2c. ábra) a baktériumok klubszerű végű, pleomorf, szabálytalanul festett Gram-pozitív pálcikákként voltak megfigyelhetők. A biokémiai vizsgálatok a következő eredményeket mutatták: Háromszoros cukor vas (TSI,-), lizin vas agar (LIA,-), citrát teszt (CIT,-), szulfid indol-motilitás (SIM,-), motilitás, indol, ornitin (MIO,-), oxidatív-fermentatív (OF,-) metilvörös (-), peptonvíz (-), Voger Pascaguer (-), karbamid (-), nitrátleves (+), trehalóz (+), szacharóz (+), maltóz (+) és glükóz fermentáció (37 °C-on pozitív, 42 °C-on negatív). Ezek az eredmények megfelelhetnek a C. pseudotuberculosis profilnak, kivéve a karbamid tesztet, amely pozitív helyett negatív volt, és ezért jobban egyezik a C. xerosis profillal . A diagnosztikai eredmények nem voltak meggyőzőek, ezért, még ha az API-rendszer nem is specifikus a C. xerosis azonosítására, úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk az izolátumot ezzel a rendszerrel, hogy lássuk, ez az izolátum azonosítható-e más Corynebacterium fajként. Továbbá, hogy kiderítsük, hogy ez az izolátum más fajokhoz tartozik-e, mint például a C. freneyi és a C. amycolatum, amelyek ritkán fordulnak elő juhokban, megvizsgáltuk, hogy a kolónia képes-e 20 °C-on növekedni, és képes-e 42 °C-on glükózt fermentálni. Az izolátum 20 °C-on jól növekedett, és 42 °C-on nem fermentálta a glükózt, mindkét jellemzőt a C. xerosisra és a C. hansenii-re asszociálták, ezért úgy döntöttünk, hogy molekuláris elemzést végzünk, hogy kiderítsük, molekulárisan azonosítani tudjuk-e az izolátumot C. xerosis-ként. A diagnosztikai pontosság növelése érdekében három lókuszt elemeztünk. Vizsgáltunk egy olyan gént, amely a C. xerosisban általában hiányzik, de a C. pseudotuberculosisban jelen van, a pld gént, ahol a PCR vizsgálat után várhatóan nem találunk amplikont, ha az izolátum C. xerosis, szemben a C. pseudotuberculosisszal. pseudotuberculosis, amely egy 203 bp-s sávot amplifikál; egy második lokusz a 16S-23S rRNS-gének intergenikus spacer régiójának (16S-23S) amplifikációját célozta meg C. pseudotuberculosisra tervezett primerekkel, amelyekről azt jelentették, hogy nem működnek C. xerosisra , és szintén nem vártunk amplifikációs sávot C. xerosisra és 816 bp-s sávot C. pseudotuberculosisra. Végül elvégeztük az rpoB gén (446 bp) PCR-amplifikációját és szekvenálását, amelyről korábban már beszámoltak, hogy megkülönbözteti a Corynebacterium fajokat. A DNS extrakciót egy kereskedelmi készlet (KAPA Express Extract) segítségével végeztük a gyártó protokollját követve. A pld, 16S-23S és rpoB gének részleges szekvenciáinak amplifikálására multiplex-PCR technikát végeztünk a Pacheco által 2007-ben közzétett protokoll szerint. A reakciókat egy kereskedelmi multiplex PCR-készlettel (QIAGEN Multiplex PCR) végeztük a gyártó előírásait követve. A PCR-elemzés a következő mintákra terjedt ki: A jellemzendő izolátum, a feltételezett C. xerosis izolátum és két C. pseudotuberculosis (egy korábban biovar ovis-ként jellemzett helyi izolátum és egy referencia törzs, ATCC 43924, biovar equi), amelyeket kontrollként használtak. Amint az a feltételezett C. xerosis esetében várható volt, egyetlen PCR 446 bp amplikon sávot amplifikáltak, amely az rpoB gén fragmentumának felel meg, és az intergenikus 16S-23S gén és a pld gén fragmentumai nem amplifikálódtak. Szintén a várakozásoknak megfelelően mindkét C. pseudotuberculosis törzs három 203, 446 és 816 bp sávot mutatott ki, amelyek a pld, rpoB és 16S géneknek feleltek meg (3. ábra). Mindhárom minta RpoB génamplikonjait a Promega tisztító kit (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) segítségével tisztítottuk, és a Macrogen (Rockville, MD, USA) automatikus szekvenálásra küldte. A BLAST (NCBI) segítségével kapott többszörös szekvenciaillesztéseket a Mega 6.0.6-os Clustal W analízis segítségével elemeztük az izolátumaink szekvenciáival együtt (4. ábra). A filogenetikai elemzést a neighbour-joining módszerrel végeztük (MEGA szoftver 6.0.6). A Bootstrap-értékeket 1000 véletlenszerű fa generálásával kaptuk. A filogenetikai elemzésbe bevontuk a C. xerosis (GenBank AY492233.1), a C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) és a C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2) rpoB génjének szekvenciáit is. Különböző filogenetikai csoportokat lehetett megfigyelni, amelyek a Corynebacterium egyes fajainak feleltek meg. Ezek az eredmények, megerősítik, hogy a jelen tanulmány izolátuma (rpoB C53) C. xerosis (4. ábra).

A genotipizálási technikák, mint például a PCR, valamint az rpoB C53 izolátum szekvenciaelemzése ebben a tanulmányban nagyban hozzájárultak a helyes fajmeghatározáshoz, amely eredetileg félrevezető volt a fenotípusos mikroszkópos és biokémiai jellemzők használata esetén. A Corynebacterium xerosisról korábban már beszámoltak emberi esetek klinikai mintáiban endocarditis, pneumonitis, osteomyelitis és bőrfertőzések elváltozásaiban, különösen immunhiányos betegeknél . Állati klinikai mintákban is kimutatták, például kecske májának elváltozásaiban (pszeudotuberkulózis gyanúja) és tehéntejben, tőgygyulladásban szenvedő állatokból. Sertésben a C. xerosis-t különböző szövetek, például a máj, a vese, a tüdő, a lép, az ízületek, valamint a bőr alatti tályogok elváltozásaiból izolálták. Ezenkívül a C. xerosis-t izolálták juhok méhének klinikai mintáiból, abortusz esetén, és tüdőszövetből, légzési problémákkal küzdő állatokból. Ezeket az izolátumokat az rRNS 16S-23S gén PCR-RFLP segítségével történő felerősítésével azonosították és jellemezték. Ezekben a vizsgálatokban azonban nem sikerült elég egyértelmű sávmintázatot kapni ahhoz, hogy a C. xerosis-t meg lehessen különböztetni a Corynebacterium más fajaitól. A szerzők a 16S és az rpoB gének elemzését és szekvencia-összehasonlítását is elvégezték, ami lehetővé tette számukra a C. xerosis megkülönböztetését más, a Corynebacteriumhoz genetikailag hasonló fajoktól .

Amint már említettük, ezt a vizsgálatot az rpoB gén jelenléte alapján végezték, amelyet más szerzők a Corynebacterium nemzetség filogenetikai elemzéséhez választott génként jelentettek be, mivel nagy polimorfizmust mutat, még a 16S-23S rRNS gének intergenikus spacer régiójánál is nagyobbat . Ismert, hogy a juhok bőr tályogjait (caseosus lymphadenitis) a C. pseudotuberculosis okozza, és a virulencia és patogenitás fő tényezője a foszfolipáz D exotoxin, amelyet a pld gén kódol, és a baktérium sejtmembránjában fejeződik ki . Ez az exotoxin egy permeabilitási tényező, amely elősegíti az emlősök sejtmembránjában lévő szfingomielin észterkötéseinek hidrolízisét, és valószínűleg hozzájárul a baktériumoknak a fertőzés kezdeti helyéről a nyirokrendszeren keresztül a regionális ganglionokba jutó másodlagos helyekre történő terjedéséhez, és úgy tűnik, hogy a fertőzést követően részt vesz a makrofágok életképességének csökkentésében . Az exotoxin dermonekrotikus elváltozásokat is okoz . Ezt az exotoxint azonban a C. xerosisban nem jelentették olyan patogén toxinként, amely hozzájárulhatna a tályogok kialakulásához. Ez rávilágít annak fontosságára, hogy további kutatásokat végezzenek az ebben a Corynebacterium fajban jelen lévő fertőzési mechanizmusokkal kapcsolatban.

A járványügyi természetű viták egyik fontos pontja az a tény, hogy a juhtenyésztési rendszert, ahonnan a mintát nyerték, korábban sertések számára használták, egy olyan faj, ahol a C. xerosis-t gyakori kórokozóként jelentették . Ezenkívül a juhok takarmányának egyik fő összetevője sertés melléktermékeket tartalmaz (sertéstrágya-trágya), amelyek esetleg aktív kórokozókat tartalmazhatnak, köztük talán a Corynebacterium spp. Ezenfelül a létesítményekben mindenütt elterjedtek az olyan éles tárgyak, mint a fémrudak, szögek és drótok, amelyek növelik az állatok sérülésének esélyét, és lehetőséget adnak a Corynebacterium spp. bejutására a szervezetbe, beleértve a C. xerosis-t is. Mindezek a tényezők hozzájárulhattak a C. xerosis jelenlétéhez a létesítményen belül. További vizsgálatokat nem végeztek, azonban a tulajdonosnak azt javasolták, hogy minden állat tályogja le és fertőtlenítse a tályogokat, a fertőzéseket tartalmazó területen (a kórokozók terjedésének elkerülése érdekében), erősítse meg a karámok tisztítását, és távolítson el minden éles élt és tárgyat a kerítésekről, az etetőkről és a padlókról. Mivel a C. xerosis, valamint a C. pseudotuberculosis potenciálisan zoonotikus mikroorganizmusok, a gazdának ajánlást tettek, hogy az állatok és a gazdaságban keletkező hulladékok kezelése során tegyen rendkívüli óvintézkedéseket az emberi és állati fertőzés, valamint a mikroorganizmus más gazdaságokba való esetleges átterjedésének megelőzése érdekében.