A PD-k megelőzésének egyik megközelítése a PCR-rendszer fizikai-kémiai optimalizálásából áll, azaz a primerek, a magnézium-klorid, a nukleotidok koncentrációjának, az ionerősségnek és a reakció hőmérsékletének megváltoztatásából. Ezt a módszert némileg korlátozzák a fizikai-kémiai jellemzők, amelyek a PCR-ben a célszekvencia amplifikációjának hatékonyságát is meghatározzák. Ezért a PD-k képződésének csökkentése a PCR hatékonyságának csökkenését is eredményezheti. E korlátozás leküzdésére más módszerek csak a PD-k kialakulásának csökkentésére irányulnak, beleértve a primertervezést és a különböző PCR-enzimrendszerek vagy reagensek használatát.
Primertervezési szoftverekSzerkesztés
A primertervezési szoftverek olyan algoritmusokat használnak, amelyek ellenőrzik a DNS másodlagos szerkezetének kialakulásának és a primerek önmagukhoz vagy a primerpárokon belüli lágyulásának lehetőségét. A szoftver által figyelembe vett fizikai paraméterek a következők: a primerek potenciális önkomplementaritása és GC-tartalma; a primerek hasonló olvadási hőmérséklete; és a másodlagos struktúrák, például szárhurok hiánya a DNS-célszekvenciában.
Hot-start PCREdit
Mivel a primereket úgy tervezték, hogy egymáshoz alacsony komplementaritással rendelkezzenek, ezért csak alacsony hőmérsékleten, például szobahőmérsékleten, például a reakcióelegy elkészítése során kapcsolódhatnak (az ábrán az I. lépés). Bár a PCR-ben használt DNS-polimerázok 70 °C körül a legaktívabbak, alacsonyabb hőmérsékleten is rendelkeznek némi polimerizációs aktivitással, ami a primerek egymáshoz lágyulása után DNS-szintézist okozhat a primerekből. Számos módszert dolgoztak ki a PD-k képződésének megakadályozására, amíg a reakció el nem éri az üzemi hőmérsékletet (60-70 °C), és ezek közé tartozik a DNS-polimeráz kezdeti gátlása, vagy a reakciókomponensek fizikai szétválasztása a reakcióelegy magasabb hőmérsékletre történő eljutásáig. Ezeket a módszereket hot-start PCR-nek nevezik.
Vax: ennél a módszernél az enzimet térben elválasztják a reakcióelegytől viasszal, amely megolvad, amikor a reakció eléri a magas hőmérsékletet.
Magnézium lassú felszabadítása: A DNS-polimeráznak magnéziumionokra van szüksége az aktivitáshoz, ezért a magnéziumot kémiailag elválasztják a reakciótól egy kémiai vegyülethez kötődve, és csak magas hőmérsékleten szabadul fel az oldatba
Inhibitor nem-kovalens kötése: ebben a módszerben egy peptid, antitest vagy aptamer alacsony hőmérsékleten nem-kovalens módon kötődik az enzimhez és gátolja annak aktivitását. A 95 °C-on történő 1-5 perces inkubáció után az inhibitor felszabadul és a reakció elindul.
Hidegérzékeny Taq-polimeráz: egy olyan módosított DNS-polimeráz, amelynek alacsony hőmérsékleten szinte nincs aktivitása.
Kémiai módosítás: ebben a módszerben egy kis molekulát kovalensen kötnek egy aminosav oldalláncához a DNS-polimeráz aktív helyén. A kismolekula a reakcióelegy 10-15 perces, 95 °C-on történő inkubálásával szabadul fel az enzimről. A kis molekula felszabadulása után az enzim aktiválódik.
Primerek szerkezeti módosításaSzerkesztés
A PD-képződés megakadályozásának vagy csökkentésének másik megközelítése a primerek olyan módosítása, hogy önmagukkal vagy egymással történő lágyulásuk ne okozzon hosszabbodást.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): a primer 5′ végéhez egy, a primer 3′ végéhez komplementer nukleotidfarkat adunk. Az 5′ farok közelsége miatt a primer 3′ végéhez kapcsolódik. Az eredmény egy stem-loop primer, amely kizárja a rövidebb átfedésekkel járó lágyulást, de lehetővé teszi a primer lágyulását a célpontban lévő teljesen komplementer szekvenciához.
Kimerikus primerek: a primer egyes DNS-bázisait RNS-bázisokkal helyettesítik, így egy kiméra szekvencia jön létre. A kiméra szekvencia olvadási hőmérséklete egy másik kiméra szekvenciával alacsonyabb, mint a kiméra szekvenciáé a DNS-sel. Ez a különbség lehetővé teszi a lágyulási hőmérséklet olyan beállítását, hogy a primer a célszekvenciához lágyuljon, de más kiméra primerekhez ne.
Blokkolt-lebontható primerek: az RNáz H-függő PCR (rhPCR) néven ismert módszer egy termostabil RNáz HII-t használ a blokkoló csoport magas hőmérsékleten történő eltávolítására a PCR-primerekről. Ez az RNáz HII enzim alacsony hőmérsékleten szinte semmilyen aktivitást nem mutat, így a blokk eltávolítása csak magas hőmérsékleten történik. Az enzim emellett inherens primer:template mismatch diszkriminációval is rendelkezik, ami további szelekciót eredményez a primer-dimerekkel szemben.
A primer-dimerekből származó jelfelvétel megakadályozásaSzerkesztés
Míg a fenti módszerek célja a PD-képződés csökkentése, egy másik megközelítés célja a PD-kből származó jel minimalizálása a kvantitatív PCR-ben. Ez a megközelítés mindaddig hasznos, amíg kevés PD képződik, és a termékfelhalmozódást gátló hatásuk csekély.
Négylépéses PCR: nemspecifikus festékekkel, például SYBR Green I-vel való munka esetén használatos. A PD-k és a célszekvencia eltérő hosszán, és így eltérő olvadási hőmérsékletén alapul. Ennél a módszernél a jelet a célszekvencia olvadási hőmérséklete alatt, de a PD-k olvadási hőmérséklete felett nyerjük.
Szekvenciaspecifikus szondák: A TaqMan és a molecular beacon szondák csak a célszekvenciájuk (komplementer) jelenlétében generálnak jelet, és ez a fokozott specificitás kizárja a PD-k jelszerzését (de a termékfelhalmozódásra gyakorolt esetleges gátló hatást nem).