APL oferuje usługi analizy w żelu natywnym od 1998 roku. Obecnie wiele laboratoriów niestety ignoruje to cenne narzędzie, ponieważ uważają, że żele natywne są po prostu zbyt trudne w użyciu lub mylnie sądzą, że można je stosować tylko do białek kwaśnych. W Alliance Protein Laboratories rutynowo wykonujemy natywne żele zarówno na białkach zasadowych jak i kwasowych. Chętnie wykonamy dla Państwa próbki i/lub będziemy współpracować z Państwem w celu opracowania protokołu do wykorzystania w Państwa laboratorium.
Co to jest żel natywny?
„Natywna” lub „niedenaturująca” elektroforeza żelowa jest przeprowadzana przy braku SDS. Podczas gdy w SDS-PAGE ruchliwość elektroforetyczna białek zależy przede wszystkim od ich masy cząsteczkowej, w natywnym PAGE ruchliwość zależy zarówno od ładunku białka, jak i jego wielkości hydrodynamicznej.
Ładunek elektryczny napędzający elektroforezę jest regulowany przez ładunek własny białka przy pH buforu. Ładunek ten będzie oczywiście zależał od składu aminokwasowego białka, jak również od modyfikacji potranslacyjnych, takich jak dodanie kwasów sialowych.
Ponieważ białko zachowuje swoją sfałdowaną konformację, jego rozmiar hydrodynamiczny i ruchliwość na żelu będą się również różnić w zależności od charakteru tej konformacji (większa ruchliwość dla bardziej zwartych konformacji, mniejsza dla większych struktur, takich jak oligomery). Jeśli natywny PAGE jest przeprowadzany w pobliżu neutralnego pH, aby uniknąć kwasowej lub zasadowej denaturacji, wtedy może być używany do badania konformacji, samoasocjacji lub agregacji oraz wiązania innych białek lub związków.
Żele natywne mogą być wrażliwe na każdy proces, który zmienia ładunek lub konformację białka. Czyni je to doskonałymi narzędziami do wykrywania takich rzeczy jak:
-
zmiana ładunku spowodowana degradacją chemiczną (np. deamidacja)
-
fałdowanie, „stopiona kula”, lub inne zmodyfikowane konformacje
-
oligomery i agregaty (zarówno kowalencyjne jak i niekowalencyjne)
-
zdarzenia wiążące (białko-białko lub białko-ligand)
Te właściwości, oraz ich stosunkowo wysoka wydajność, czynią żele natywne doskonałymi narzędziami do analizy próbek o przyspieszonej stabilności, wykazywania porównywalności różnych partii lub procesów, lub badania wpływu substancji pomocniczych.
Inną zaletą żeli natywnych jest możliwość odzyskiwania białek w ich stanie natywnym po rozdzieleniu. Odzyskanie aktywnych materiałów biologicznych może być jednak konieczne przed jakimkolwiek utrwalaniem lub barwieniem.
Zauważ, że żele natywne omawiane tutaj są obecnie czasami nazywane „czystymi żelami natywnymi”. Różnią się one zasadniczo od tak zwanych „niebieskich żeli natywnych”, które zależą od wiązania barwnika, aby nadać białku bardzo wysoki ładunek elektryczny, przewyższający ładunek wewnętrzny polipeptydu. Jeśli przyjmiemy, że ilość związanego barwnika jest proporcjonalna do masy białka, wówczas ruchliwość obserwowana przy użyciu protokołu „blue native” może być użyta do oszacowania masy molowej poprzez porównanie ze standardami białek, podobnie jak w przypadku SDS-PAGE. Standardy masy sprzedawane do użytku z niebieskimi żelami natywnymi nie mogą być używane do szacowania mas molowych dla prawdziwych żeli natywnych, które są tutaj omawiane.