Subjects
This study involved 88 treatment-naïve LC patients without distant metastasis. U wszystkich pacjentów rozpoznano raka płaskonabłonkowego krtani na podstawie badania patologicznego próbek i byli oni leczeni w Department of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery, University of the Ryukyus, w okresie od stycznia 2008 do grudnia 2017 roku. Ostateczne rokowanie pacjentów zostało ocenione w lipcu 2018 roku. Klasyfikację stopnia zaawansowania guza, węzła, przerzutów (TNM) przeprowadzono zgodnie z AJCC Staging Manual (7th edition). Aby określić stadium kliniczne i wykryć współistniejące mnogie nowotwory pierwotne, pacjenci przeszli badania fizyczne i endoskopowe górnego odcinka przewodu pokarmowego, inspekcję ultradźwiękową szyi, tomografię komputerową (CT) i obrazowanie tomografii emisyjnej 18F-fluorodeoksyglukozy.
To badanie zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of the University of the Ryukyus i zostało przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską z 1975 r., Zrewidowaną w 2008 r. Przed włączeniem do badania uzyskano świadomą zgodę wszystkich pacjentów z LC.
Leczenie
Głównym leczeniem zmiany pierwotnej z zamiarem wyleczenia była sama konwencjonalna radioterapia (RT) lub resekcja laserowa w T1, jednoczesna chemioradioterapia (CCRT) w T2, CCRT lub chirurgia w T3 oraz chirurgia w T4, niezależnie od obecności wirusa HPV. W przypadku zmian węzłowych stosowano CCRT lub dyssekcję szyi połączoną z resekcją zmiany pierwotnej. Wszyscy chorzy, którzy otrzymali RT (dawka całkowita 70 Gy), mieli wspomagane przez CT trójwymiarowe planowanie radioterapii w pozycji zabiegowej z unieruchomieniem maski. Protokół dla CCRT był taki, jak opisano wcześniej. Gdy guz pierwotny w T3 nie wykazał częściowej odpowiedzi niezależnie od odpowiedzi węzłów chłonnych szyi przy napromienianiu dawką 39,6 Gy, u pacjentów wykonano operację leczniczą zmiany pierwotnej w połączeniu z dyssekcją szyi.
Detekcja statusu HPV i immunohistochemia p16
Wszystkie próbki tkanek ze zmian pierwotnych bez napromieniania lub chemioterapii były analizowane za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w celu wykrycia DNA HPV przy użyciu świeżo zamrożonych próbek, które zostały uzyskane podczas biopsji lub resekcji chirurgicznej, oraz immunohistochemii p16 przy użyciu próbek FFPE. Przypadki z negatywnym wynikiem detekcji HPV w PCR i nadekspresją p16 (≥75% komórek pozytywnych i co najmniej umiarkowana intensywność barwienia) były dalej oceniane pod kątem statusu HPV za pomocą hybrydyzacji in situ (ISH) z sondami DNA HPV (DNA ISH). Ilościowa PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) dla wiremii i statusu fizycznego, jak opisano poniżej, została przeprowadzona w przypadkach nosicielstwa HPV-16 .
PCR do wykrywania DNA HPV
W skrócie, DNA zostało wyizolowane z próbek guza przy użyciu Gentra Puregene Tissue Kit (QIAGEN, Germantown, MD). Obecność i integralność DNA zostały zweryfikowane we wszystkich próbkach przez amplifikację genu β-globiny PCR przy użyciu primerów PC04 i GH20 . Zestawy primerów o ogólnym konsensusie GP5+/GP6+ i MY09/MY11 zostały użyte do analizy obecności DNA HPV metodą PCR (Tabela 1), jak opisano wcześniej . Dodatkowo, próbki DNA negatywne dla GP5+/GP6+ lub MY09/MY11 PCR były ponownie amplifikowane przy użyciu metody zagnieżdżonej PCR z parą primerów GP5+/GP6+. Produkty PCR o oczekiwanej wielkości (GP5+/GP6+, 150 bp; MY09/MY11, 450 bp) były oczyszczane i sekwencjonowane bezpośrednio za pomocą analizatora genetycznego ABI PRISM 3130xl (Applied Biosystems, Foster City, CA). Sekwencje zostały wyrównane i porównane przy użyciu programu BLAST z sekwencjami znanych typów HPV w bazie danych GenBank.
p16 immunohistochemia
Immunohistochemię dla p16 wykonano przy użyciu zestawu CINTec® p16 Histology Kit (MTM Laboratories; Roche Applied Sciences, Penzberg, Niemcy) zgodnie z protokołem producenta. Immunolabeling był wizualizowany przez inkubację w 3,3′-diaminobenzydynie, a wybarwione szkiełka były kontrbarwione hematoksyliną.
Kryteria punktacji dla immunoreaktywności p16 stosowane w niniejszym badaniu były następujące: 0, brak barwienia; 1, 1 – < 25% komórek nowotworowych pozytywnych dla p16; 2, 25 – < 50% pozytywnych; 3, 50 – < 75% pozytywnych; 4, ≥75% pozytywnych i słaba intensywność barwienia; oraz 5, ≥75% pozytywnych i co najmniej umiarkowana intensywność barwienia. Termin „nadekspresja p16” (p16-dodatnia) został zdefiniowany jako wynik 5 w obecnym badaniu.
ISH z sondami DNA HPV
Biotinyl tyramide-based ISH przeprowadzono przy użyciu biotynylowanej sondy DNA GenPoint™ HPV i systemu wzmacniania sygnału GenPoint tyramide dla sond biotynylowanych zgodnie z protokołem producenta (Dako; Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Biotynowana sonda DNA GenPoint HPV reaguje z HPV typu 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 i 68 w wycinkach o grubości 4 μm próbek FFPE. Detekcję zhybrydyzowanej sondy przeprowadzono przy użyciu systemu detekcyjnego GenPoint zgodnie z protokołem producenta, z włączonym pierwotnym przeciwutleniaczem streptawidyna-peroksydaza chrzanowa (HRP), tyramid biotynylu, wtórnym przeciwutleniaczem streptawidyna-HRP i 3,3′-diaminobenzydyną l (Dako; Agilent Technologies). Szkiełka barwiono hematoksyliną.
Oszacowanie obciążenia wirusowego i statusu fizycznego HPV-16 metodą qPCR
Aby ocenić obciążenie wirusowe i status fizyczny HPV-16, qPCR przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem. W skrócie, użyto primerów i sond TaqMan celujących w otwarte ramki odczytu HPV-16 E2 i E6 (Tabela 1). Startery i sondy rozpoznają region zawiasowy E2, który jest usuwany podczas integracji HPV-16. Dwie krzywe standardowe dla genów E2 i E6 zostały utworzone przez amplifikację 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń (101, 102, 103, 104, 105 i 106 kopii wirusowych) plazmidu pB-actin early, który był darem od Karla Mungera, niosącego kompletny region wczesnego genu HPV-16 (plazmid Addgene # 13711; Addgene, Cambridge, MA). Obciążenie wirusowym DNA oceniano poprzez obliczenie liczby kopii E6. Zewnętrzna krzywa wzorcowa została utworzona przy użyciu znanych seryjnych rozcieńczeń (0,3, 3, 30 i 300 ng) ludzkiego genomowego DNA łożyskowego (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy) do ilościowego oznaczenia komórkowego DNA, a β-globina została amplifikowana jak opisano wcześniej. Ilość DNA obliczano poprzez wykreślenie wartości Cq w stosunku do logarytmu krzywej standardowej. Status fizyczny HPV-16 oceniano na podstawie wcześniej opublikowanej metody. Stosunek E2/E6 ≥ 1 wskazuje na przewagę formy episomalnej, podczas gdy stosunek liczby kopii E2/całkowita liczba kopii E6 < 1 wskazuje na obecność zarówno form zintegrowanych, jak i episomalnych (forma mieszana).
Detection of E6 mRNA expression by qPCR and RNA ISH in HPV-16-positive patients with p16 overexpression
E6 mRNA expression was detected in samples from patients identified as HPV-16-positive with p16 overexpression. Całkowite RNA ekstrahowano z zamrożonych tkanek przy użyciu RNAiso Plus (Takara Bio, Kusatu, Japonia) zgodnie z instrukcjami producenta. Całkowite RNA (500 ng) zostało użyte do syntezy pierwszej nici cDNA przy użyciu zestawu PrimeScript™ RT Reagent Kit z gDNA Eraser (Perfect Real Time; Takara Bio) zgodnie z instrukcjami producenta. Aby zmierzyć ekspresję mRNA HPV-16 E6, qPCR przeprowadzono przy użyciu CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) i TaqMan PCR Master Mix II (Roche Molecular Systems, Pleasanton, CA). Użyto primerów i sond TaqMan (Tabela 1), które celują w gen HPV-16 E6 i gen β-aktyny. Sonda β-aktyny była znakowana FAM na 5′-końcu i TAMRA na 3′-końcu (Applied Biosystems Japan, Tokyo, Japonia). Warunki amplifikacji były następujące: 2 min w 50 °C, 10 min w 95 °C oraz 2-etapowy cykl 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 60 s, w sumie 40 cykli. Dwie krzywe standardowe zostały wygenerowane dla genów E6 i β-aktyny przez amplifikację seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń (101, 102, 103, 104, 105 i 106 kopii) wczesnego plazmidu pB-aktyny i plazmidu pCAG-mGFP-aktyny, który był darem od Ryohei Yasuda, niosącego kompletny region kodujący β-aktyny (plazmid Addgene # 21948; Addgene). Ekspresję genu E6 w każdej próbce normalizowano ilością wewnętrznej kontroli β-aktyny.
RNA ISH dla mRNA HPV-16/- 18 E6/E7 przeprowadzono przy użyciu zestawu RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, Newark, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, seryjne sekcje o grubości 4μm próbek FFPE były deparafinowane w ksylenie i rehydratowane przy użyciu stopniowanej serii alkoholi. Endogenna peroksydaza została zablokowana za pomocą RNAscope® Hydrogen Peroxide Reagent w temperaturze pokojowej przez 10 min. Odzyskanie docelowego RNA HPV przeprowadzono w RNAscope® Target Retrieval Reagent w temperaturze 100 °C przez 15 min. Diapozytywy trawiono przy użyciu RNAscope® Protease Plus w temp. 40 °C przez 30 min. Do wycinków dodawano sondę RNA HPV-16/- 18 E6/E7 (RNAscope® Probe-HPV16/18) i nakładano szkiełko nakrywkowe. Szkiełka przenoszono do komory nawilżonej w celu hybrydyzacji w temperaturze 40 °C przez 2 h. Następnie zdejmowano szkiełka nakrywkowe i przemywano je za pomocą RNAscope® Wash Buffer Reagent w temperaturze 40 °C. Wzmocnienie sygnału przeprowadzono zgodnie z instrukcją producenta. Wykrywanie zhybrydyzowanej sondy przeprowadzono przy użyciu 3,3′-diaminobenzydyny (RNAscope® 2.5 HD Reagent Kit). Szkiełka były barwione hematoksyliną. Szkiełka z kontrolą pozytywną (komórki HeLa wyrażające mRNA HPV-18 E6/E7) zostały włączone do RNA ISH. Dodatnie barwienie identyfikowano jako brązowe punkcikowate punkty widoczne w jądrze i/lub cytoplazmie.
Analiza statystyczna
Test chi kwadrat Pearsona został użyty do porównania charakterystyki chorych na LC w zależności od DNA HPV i statusu nadekspresji p16. Skumulowane przeżycie (CS) obliczono metodą Kaplana-Meiera i porównano między dwiema grupami za pomocą testu log-rank. Wszystkie analizy wykonano przy użyciu SPSS Statistical Package (SPSS, wersja 25.0; SPSS, IBM Corp., Armonk, NY). P < 0,05 uznano za istotne.