KOMENTARZ
Wykluczenie barwnika jest prostą i szybką techniką pomiaru żywotności komórek, ale podlega problemowi, że żywotność jest określana pośrednio na podstawie integralności błony komórkowej. Tak więc, jest możliwe, że żywotność komórki może być zagrożona (mierzona przez zdolność do wzrostu lub funkcjonowania), nawet jeśli jej integralność błony jest (przynajmniej przejściowo) zachowana. I odwrotnie, integralność błony komórkowej może być nieprawidłowa, ale komórka może być w stanie naprawić się i stać się w pełni zdolna do życia. Innym potencjalnym problemem jest to, że ponieważ absorpcja barwnika jest oceniana subiektywnie, małe ilości absorpcji barwnika wskazujące na uszkodzenie komórki mogą pozostać niezauważone. W tym względzie, wykluczenie barwnika wykonane przy użyciu barwnika fluorescencyjnego z wykorzystaniem mikroskopu fluorescencyjnego rutynowo skutkuje punktowaniem większej liczby komórek niezdolnych do życia z poborem barwnika niż testy wykonane przy użyciu błękitu trypanu z wykorzystaniem mikroskopu transmisyjnego.
Bardziej wyrafinowaną metodą pomiaru żywotności komórek jest określenie wykluczenia barwnika za pomocą cytometrii przepływowej. Można to zrobić przy użyciu błękitu trypanu, ponieważ białko to wiąże się z białkami, a następnie emituje sygnał fluorescencyjny, który można wykryć w cytometrze przepływowym (przy 660 nm, gdy jest związane z albuminą surowicy bydlęcej) (szczegóły dotyczące zastosowania błękitu trypanu w cytometrii przepływowej – patrz odnośnik 2). Alternatywnie, wykluczenie może być mierzone za pomocą innych barwników emitujących światło, takich jak jodek propidium (patrz Jednostka 5.4 w celu zapoznania się z opisem zastosowania jodku propidium do oceny żywotności komórek za pomocą analizy cytometrycznej przepływu). Szczegółowe porównanie szacunków żywych vs. martwych komórek przy użyciu wykluczenia błękitu trypanu ocenianych ręcznie, jak opisano tutaj, oraz ocenianych elektronicznie przez cytometrię przepływową wskazuje, że obie techniki dostarczają bardzo podobnych wyników w doświadczonych rękach. Podczas gdy opisana technika wykluczenia barwnika jest bardziej podatna na błędy z powodu subiektywności operatora, metoda cytometrii przepływowej jest mniej odpowiednia do oceny żywotności komórek podczas wykonywania złożonych i czasochłonnych technik oczyszczania komórek. Dlatego technika cytometrii przepływowej ma zastosowanie tylko wtedy, gdy należy uzyskać dokładne pomiary liczby martwych komórek w mieszaninie komórek.
Ostatnio zgłoszono „zautomatyzowany fluorescencyjny mikroskopowy test żywotności”, w którym żywotność komórek przy użyciu jodku propidium w połączeniu z urządzeniem zliczającym żywe i martwe komórki w przenośnym mikroskopowym liczniku komórek wyposażonym w mikroprocesor. Mówi się, że licznik ten jest w stanie ocenić żywotność komórek szybciej niż opisana tutaj technika ręczna lub cytometr przepływowy oraz uzyskać bardziej precyzyjne i wiarygodne zliczenia. Urządzenie to może być przydatne w sytuacjach, w których wymaganych jest wiele szybko uzyskanych ocen żywotności komórek (3).
Należy zauważyć, że żywotność komórek może być również oceniana za pomocą barwników, które wiążą się z DNA (monoazotek etydyny), środków, które wiążą się z fosfatydyloseryną (Aneksyna V) oraz barwników reagujących z aminami. Zastosowanie tych alternatywnych czynników wymaga zwykle cytometrii przepływowej i dlatego ma zastosowanie tylko w szczególnych warunkach.
Wykluczenie błękitu trypanu, jak opisano w powyższym protokole, można wykonać w ciągu 5 do 10 min.
.