Prezentacja przypadku
Prezentowany opis przypadku pochodzi z rutynowej wizyty weterynaryjnej w gospodarstwie hodowlanym liczącym 155 zwierząt, z dwiema rasami owiec (Pelifolk i Blackbelly), zlokalizowanym w Tesistán, gmina Zapopan, stan Jalisco, Meksyk. Obiekty w tym gospodarstwie zostały zaadaptowane z poprzedniej fermy trzody chlewnej, a w najbliższym sąsiedztwie nadal znajdują się fermy trzody chlewnej i bydła. Stado trzymano na podwyższonych podłogach w celu ułatwienia czyszczenia i obsługi, jednak w kojcach znajdowało się wiele zapieczonych ostrych przedmiotów (takich jak drut, połamane ogrodzenia, gwoździe itp.), a w czasie inspekcji czyszczenie w gospodarstwie nie było przeprowadzane prawidłowo. W żywieniu stosowano lokalnie dostępne pasze, takie jak: niskiej jakości pasze objętościowe, kiszonki z obornika świńskiego i wysokobiałkowe koncentraty paszowe. Gospodarstwo to wezwało służby weterynaryjne z powodu częstych ropni skórnych stwierdzanych u zwierząt, nie zgłoszono innych dolegliwości związanych z problemami skórnymi. Ropnie nie wydają się wpływać na produkcyjność zwierząt, jednak obecność takich zmian negatywnie wpływa na sprzedaż zwierząt, dlatego właściciel był zainteresowany poznaniem czynnika etiologicznego i zalecanego leczenia w celu wyeliminowania choroby z gospodarstwa. Treść ropni została pobrana od 31 zwierząt (29 maciorek, 1 tryka i 1 jagnięcia) przez dyplomowanego lekarza weterynarii i przesłana do laboratorium w celu diagnostyki bakteriologicznej, aby znaleźć czynniki etiologiczne, które były przyczyną problemu. Na podstawie wyglądu ropni, przypuszczalnym rozpoznaniem infekcji w gospodarstwie było kazuistyczne zapalenie węzłów chłonnych u większości zwierząt. Jednakże analiza bakteriologiczna wykazała, że 13 zwierząt było zakażonych C. pseudotuberculosis, 1 – Corynebacterium spp., 2 – Proteus spp., 2 – Streptococcus spp., a w pozostałych 13 przypadkach nie udało się zidentyfikować patogenu. Kategoryzacja dla izolatu Corynebacterium spp. była niejasna, ponieważ wyniki badań bakteriologicznych i biochemicznych nie były rozstrzygające.
W pracy opisano izolację C. xerosis od 4-miesięcznego jagnięcia rasy Pelifolk (3/4 Pelibuey, 1/4 Suffolk) w dobrej kondycji ciała. Według naszej najlepszej wiedzy jest to pierwsze doniesienie o C. xerosis powodującym kliniczny ropień skórny u owiec. Od właściciela zwierzęcia uzyskano świadomą zgodę na publikację wyników badania klinicznego, w tym materiału fotograficznego. U zwierzęcia stwierdzono ropień o twardej konsystencji, bez drenażu, na lewej stronie szyi (ryc. 1a). Wstępna diagnoza kliniczna sugerowała kazuistyczne zapalenie węzłów chłonnych, prawdopodobnie wywołane przez C.pseudotuberculosis. Próbkę do analizy bakteriologicznej uzyskano poprzez nakłucie ropnia jałową strzykawką o pojemności 5 ml, za pomocą igły podskórnej o średnicy 20 mm, po uprzednim oczyszczeniu i zdezynfekowaniu powierzchni ropnia. Rodzaj odzyskanego wysięku był surowiczy i biały w wyglądzie. Próbka biologiczna była przechowywana w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania charakterystyki biologicznej w Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA, km 15.5 drogi Toluca-Atlacomulco, Toluca, Meksyk, z.c. 50200). Czas pomiędzy pobraniem próbki a obróbką nie przekraczał 72 h. Próbkę hodowano w dwóch egzemplarzach w 8 % agarze z krwi owczej i inkubowano 24-48 h w temperaturze 37 °C w warunkach tlenowych i mikroaerofilnych. Zaobserwowano kolonie o średnicy 1,0 mm, niehemolityczne, o żółtawo-brązowym zabarwieniu i nieco suchym wyglądzie (ryc. 2a). Te cechy morfologiczne nie odpowiadały tym opisanym wcześniej dla C. pseudotuberculosis, a raczej sprawiały wrażenie kolonii z C. xerosis . Mikroskopowo (powiększenie 10×; ryc. 2c) obserwowano bakterie w postaci pałeczkowato zakończonych, pleomorficznych, nieregularnie wybarwionych prątków Gram-dodatnich. W badaniach biochemicznych uzyskano następujące wyniki: Triple sugar Iron (TSI,-), Lysine Iron agar (LIA,-), Citrate test (CIT,-), Sulphide Indole-Motility (SIM,-), Motility, Indole, Ornitine (MIO,-), Oxidative-fermentative (OF,-) Methyl red (-), Peptone Water (-), Voger Pascaguer (-), Urea (-), Nitrate Broth (+), Trehalose (+), Sucrose (+), Maltose (+) i fermentacja glukozy (pozytywna w 37 °C i negatywna w 42 °C). Wyniki te mogłyby odpowiadać profilowi C. pseudotuberculosis, z wyjątkiem testu na mocznik, który był negatywny zamiast pozytywnego, a zatem bardziej zbieżny z profilem C. xerosis . Wyniki diagnostyczne nie były rozstrzygające, dlatego, nawet jeśli system API nie jest specyficzny do identyfikacji C. xerosis, zdecydowaliśmy się zbadać izolat przy użyciu tego systemu, aby sprawdzić czy ten izolat może być zidentyfikowany jako inne gatunki Corynebacterium. Ponadto, aby dowiedzieć się czy ten izolat należy do innych gatunków takich jak C. freneyi i C. amycolatum, które rzadko występują u owiec, sprawdziliśmy czy kolonia jest w stanie rosnąć w temperaturze 20 °C i czy jest w stanie fermentować glukozę w temperaturze 42 °C. Izolat rósł prawidłowo w temperaturze 20 °C i nie fermentował glukozy w temperaturze 42 °C, obie cechy przypisywane są C. xerosis i C. hansenii, dlatego zdecydowaliśmy się na przeprowadzenie analizy molekularnej, aby sprawdzić, czy możemy molekularnie zidentyfikować izolat jako C. xerosis. Przeanalizowaliśmy trzy loci, aby zwiększyć naszą dokładność diagnostyczną. Badaliśmy gen normalnie nieobecny u C. xerosis, ale obecny u C. pseudotuberculosis, gen pld, w którym spodziewaliśmy się nie znaleźć amplikonu po teście PCR, jeśli izolat był C. xerosis, w przeciwieństwie do C. pseudotuberculosis, który amplifikowałby pasmo 203 bp; drugi locus był ukierunkowany na amplifikację regionu odstępu międzygenowego genów 16S-23S rRNA (16S-23S) przy użyciu starterów zaprojektowanych dla C. pseudotuberculosis, o których donoszono, że nie działają dla C. xerosis, i również oczekiwalibyśmy braku pasma amplifikacji dla C. xerosis i pasma 816 bp dla C. pseudotuberculosis. W końcu przeprowadziliśmy amplifikację PCR i sekwencjonowanie genu rpoB (446 bp), który wcześniej był opisywany jako czynnik różnicujący gatunki Corynebacterium . Ekstrakcja DNA została przeprowadzona przy użyciu komercyjnego zestawu (KAPA Express Extract) zgodnie z protokołem producenta. Technika Multiplex-PCR do amplifikacji częściowych sekwencji genów pld, 16S-23S i rpoB została wykonana przy użyciu protokołu opublikowanego przez Pacheco w 2007 roku. Reakcje przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu do PCR typu multiplex (QIAGEN Multiplex PCR) zgodnie z zaleceniami producenta. Analiza PCR obejmowała następujące próbki: Izolat do scharakteryzowania, izolat putatywnie C. xerosis, i dwa C. pseudotuberculosis (jeden lokalny izolat wcześniej scharakteryzowany jako biovar ovis i, szczep referencyjny, ATCC 43924, biovar equi) używane jako kontrole. Jak oczekiwano w przypadku C. xerosis, amplifikacji uległo pojedyncze pasmo PCR 446 bp, odpowiadające fragmentowi genu rpoB, natomiast fragmenty intergenicznego genu 16S-23S i genu pld nie uległy amplifikacji. Również, zgodnie z oczekiwaniami, oba szczepy C. pseudotuberculosis wykazały trzy pasma o długości 203, 446 i 816 bp, odpowiadające odpowiednio genom pld, rpoB i 16S (ryc. 3). Amplikony genu RpoB wszystkich trzech próbek oczyszczono przy użyciu zestawu do oczyszczania firmy Promega (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System) i wysłano do automatycznego sekwencjonowania przez firmę Macrogen (Rockville, MD, USA). Wielokrotne dopasowania sekwencji uzyskane z BLAST (NCBI) analizowano wraz z sekwencjami naszych izolatów przy użyciu analizy Clustal W z programu Mega 6.0.6 (ryc. 4). Analizę filogenetyczną przeprowadzono metodą sąsiedztwa-łączenia (MEGA software 6.0.6). Wartości bootstrapowe uzyskano generując 1000 losowych drzew. W analizie filogenetycznej uwzględniono również sekwencje z genu rpoB z C. xerosis (GenBank AY492233.1), C. pseudotuberculosis biovar ovis (GenBank CP002924.1) i C. pseudotuberculosis biovar equi (GenBank CP003540.2). Możliwe było zaobserwowanie różnych grup filogenetycznych, które odpowiadały poszczególnym gatunkom Corynebacterium. Wyniki te, potwierdzają, że izolat z niniejszej pracy (rpoB C53) jest C. xerosis (ryc. 4).
Badany ropień. Ropień o twardej konsystencji bez drenażu odnotowano w okolicy szyi u 4-miesięcznego jagnięcia
In-vitro Posiew bakteriologiczny Corynebacterium xerosis i Corynebacterium pseudotuberculosis. Bakterie hodowano na 8 % agarze z krwią baranią. aCorynebacterium pseudotuberculosis (ATCC 43924) wykazywała białawe kolonie z hemolizą beta. bCorynebacterium xerosis, rosła jako małe żółtawo-brązowe kolonie bez hemolizy. cWybarwiony metodą Grama preparat rozmazowy Corynebacterium xerosis, ukazujący charakterystyczne pleomorficzne Gram-dodatnie pręciki, z końcami przypominającymi pałeczki
Multiplex PCR. Amplifikacja częściowych sekwencji genów 16S rRNA, rpoB i pld. Pas MW: marker masy molekularnej 1 Kb Plus DNA Ladder™ (Invitrogen). Pas 1: kontrola negatywna (reakcja bez szablonu DNA). Pas 2: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar equi. Pasy 3-4: izolat Corynebacterium xerosis (odpowiednio 10-0,001 ng DNA). Pas 5: Corynebacterium pseudotuberculosis biovar ovis
Analiza bioinformatyczna. a Przedstawia wyrównanie sekwencji z sekwencji użytych do skonstruowania drzewa filogenetycznego w (b). Trzy sekwencje zostały pobrane z GenBank: C. pseudotuberculosis biovar ovis (CP002924.1), C. pseudotuberculosis biovar equi (CP003540.2) i Corynebacterium xerosis (AY492233.1). Pozostałe trzy były próbkami wysłanymi do sekwencjonowania (Macrogen, Rockville, MD, USA): rpoB13 (lokalny izolat scharakteryzowany jako C. pseudotuberculosis, biovar ovis), rpoB C1 (C. pseudotuberculosis, biovar equi, szczep referencyjny ATCC43924) i rpoB C53 (lokalny izolat, scharakteryzowany jako C. xerosis). b Drzewo pokazuje genetyczne pokrewieństwo Corynebacterium pseudotuberculosis i Corynebcaterium xerosis dla genu rpoB. Drzewo zostało zbudowane na podstawie wyrównania częściowej sekwencji tego genu. Wartości Bootstrap uzyskano generując 1000 losowych drzew, a siła każdej gałęzi jest wskazana w odpowiednim węźle
Techniki genotypowania, takie jak PCR, jak również analiza sekwencji rpoB C53 izolatu w tym badaniu w znacznym stopniu przyczyniły się do prawidłowej identyfikacji gatunkowej, która początkowo była mylna przy użyciu fenotypowych cech mikroskopowych i biochemicznych. Corynebacterium xerosis była wcześniej opisywana w próbkach klinicznych przypadków ludzkich w zmianach chorobowych w zapaleniu wsierdzia, zapaleniu płuc, zapaleniu kości i szpiku oraz infekcjach skóry, szczególnie u pacjentów z obniżoną odpornością. Znaleziono go również w próbkach klinicznych od zwierząt, na przykład w zmianach chorobowych wątroby kóz (podejrzenie pseudotuberculosis), oraz w mleku krów, od zwierząt z mastitis. U świń C. xerosis był izolowany ze zmian w różnych tkankach, takich jak wątroba, nerki, płuca, śledziona, stawy, a także z ropni podskórnych. Dodatkowo, C. xerosis został wyizolowany z próbek klinicznych macicy owiec, w przypadku poronienia, oraz z tkanki płucnej, od zwierząt z problemami oddechowymi. Izolaty te zostały zidentyfikowane i scharakteryzowane poprzez amplifikację genu rRNA 16S-23S metodą PCR-RFLP. Jednakże w tych badaniach nie udało się uzyskać wzoru pasm wystarczająco wyraźnego, aby odróżnić C. xerosis od innych gatunków Corynebacterium. Autorzy przeprowadzili również analizę i porównanie sekwencji genów 16S i rpoB, co pozwoliło im na odróżnienie C. xerosis od innych gatunków, genetycznie podobnych do Corynebacterium.
Jak wspomniano powyżej, badanie to zostało przeprowadzone w oparciu o obecność genu rpoB, który został zgłoszony przez innych autorów jako gen z wyboru do analizy filogenetycznej rodzaju Corynebacterium, ponieważ wykazuje wysoki polimorfizm, nawet większy niż region odstępu międzygenowego genów 16S-23S rRNA. Wiadomo, że ropnie skórne u owiec (kazuistyczne zapalenie węzłów chłonnych) są wywoływane przez C. pseudotuberculosis, a ich głównym czynnikiem wirulencji i patogenności jest egzotoksyna fosfolipaza D, kodowana przez gen pld i ulegająca ekspresji w błonie komórkowej bakterii. Egzotoksyna ta jest czynnikiem przepuszczalności, który promuje hydrolizę wiązań estrowych w sfingomielinie w błonach komórkowych ssaków, prawdopodobnie przyczyniając się do rozprzestrzeniania się bakterii z początkowego miejsca zakażenia do miejsc wtórnych poprzez układ limfatyczny do zwojów regionalnych, i wydaje się być zaangażowana w zmniejszenie żywotności makrofagów po zakażeniu. Egzotoksyna ta powoduje również zmiany dermonekrotyczne. Jednakże, egzotoksyna ta nie została opisana u C. xerosis jako toksyna patogenna, która mogłaby przyczynić się do rozwoju ropni. Podkreśla to znaczenie prowadzenia dalszych badań dotyczących mechanizmów infekcji obecnych w tym gatunku Corynebacterium.
Poważnym punktem dyskusji o charakterze epidemiologicznym jest fakt, że system produkcji owiec, z którego uzyskano próbkę, był wcześniej używany dla świń, gatunku, w którym C. xerosis został zgłoszony jako powszechny patogen. Ponadto, jednym z głównych składników diety owiec są produkty uboczne pochodzące od świń (świński obornik – kiszonka), które mogą zawierać aktywne patogeny, w tym Corynebacterium spp. Ponadto, ostre przedmioty, takie jak metalowe pręty, gwoździe i druty, są szeroko rozpowszechnione w całym obiekcie, co zwiększa prawdopodobieństwo zranienia zwierząt, otwierając drogę wejścia Corynebacterium spp. do organizmu, w tym C. xerosis. Wszystkie te czynniki mogły przyczynić się do obecności C. xerosis na terenie obiektu. Nie przeprowadzono dalszych badań, jednakże zaleceniem dla właściciela było usunięcie i zdezynfekowanie ropni u wszystkich zwierząt, w miejscu zawierającym infekcję (w celu uniknięcia rozprzestrzeniania się patogenów), wzmocnienie czyszczenia kojców oraz usunięcie wszystkich ostrych krawędzi i przedmiotów z ogrodzeń, karmników i podłóg. Ponieważ C. xerosis, jak również C. pseudotuberculosis, są potencjalnie odzwierzęcymi mikroorganizmami, wydano zalecenia dla hodowcy, aby zachował najwyższe środki ostrożności podczas obchodzenia się ze zwierzętami i odpadami wytwarzanymi przez gospodarstwo, aby zapobiec zakażeniu ludzi i zwierząt oraz możliwemu rozprzestrzenianiu się mikroorganizmów do innych gospodarstw.
.