Jedno z podejść do zapobiegania PD polega na fizyko-chemicznej optymalizacji systemu PCR, tj. zmianie stężeń primerów, chlorku magnezu, nukleotydów, siły jonowej i temperatury reakcji. Metoda ta jest w pewnym stopniu ograniczona przez właściwości fizyko-chemiczne, które również decydują o wydajności amplifikacji sekwencji docelowej w PCR. Dlatego zmniejszenie tworzenia PDs może również skutkować zmniejszoną wydajnością PCR. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, inne metody mają na celu zmniejszenie powstawania tylko PD, włączając w to projektowanie primerów i stosowanie różnych systemów enzymatycznych PCR lub odczynników.
Oprogramowanie do projektowania primerówEdit
Oprogramowanie do projektowania primerów wykorzystuje algorytmy, które sprawdzają potencjał tworzenia struktury drugorzędowej DNA i annealingu primerów do siebie lub w obrębie par primerów. Parametry fizyczne, które są brane pod uwagę przez oprogramowanie, to potencjalna samokomplementarność i zawartość GC w starterach; podobne temperatury topnienia starterów; oraz brak struktur drugorzędowych, takich jak pętle łodygowe, w docelowej sekwencji DNA.
Hot-start PCREdit
Ponieważ startery są zaprojektowane tak, aby miały niską komplementarność względem siebie, mogą one annealować (krok I na rysunku) tylko w niskiej temperaturze, np. w temperaturze pokojowej, np. podczas przygotowywania mieszaniny reakcyjnej. Chociaż polimerazy DNA stosowane w PCR są najbardziej aktywne w temperaturze około 70 °C, to wykazują pewną aktywność polimeryzacyjną również w niższych temperaturach, co może powodować syntezę DNA ze starterów po ich wzajemnym annealingu. Opracowano kilka metod zapobiegania powstawaniu PDs do czasu osiągnięcia przez reakcję temperatury roboczej (60-70 °C), które obejmują wstępne zahamowanie polimerazy DNA lub fizyczne rozdzielenie składników reakcji do czasu osiągnięcia przez mieszaninę reakcyjną wyższych temperatur. Metody te są określane jako hot-start PCR.
Wosk: w tej metodzie enzym jest przestrzennie oddzielony od mieszaniny reakcyjnej woskiem, który topi się, gdy reakcja osiąga wysoką temperaturę.
Powolne uwalnianie magnezu: Polimeraza DNA wymaga do aktywności jonów magnezu, dlatego magnez jest chemicznie oddzielany od reakcji poprzez związanie ze związkiem chemicznym i uwalniany do roztworu dopiero w wysokiej temperaturze
Niekowalencyjne wiązanie inhibitora: w tej metodzie peptyd, przeciwciało lub aptamer są niekowalencyjnie związane z enzymem w niskiej temperaturze i hamują jego aktywność. Po inkubacji trwającej 1-5 minut w temperaturze 95 °C, inhibitor jest uwalniany i rozpoczyna się reakcja.
Wrażliwa na zimno polimeraza Taq: jest zmodyfikowaną polimerazą DNA, która prawie nie wykazuje aktywności w niskiej temperaturze.
Modyfikacja chemiczna: w tej metodzie mała cząsteczka jest kowalencyjnie związana z łańcuchem bocznym aminokwasu w miejscu aktywnym polimerazy DNA. Mała cząsteczka jest uwalniana z enzymu poprzez inkubację mieszaniny reakcyjnej przez 10-15 minut w temperaturze 95 °C. Po uwolnieniu małej cząsteczki enzym jest aktywowany.
Modyfikacje strukturalne primerówEdit
Innym podejściem do zapobiegania lub ograniczania tworzenia PD jest modyfikacja primerów tak, aby annealing z sobą lub między sobą nie powodował wydłużenia.
HANDS (Homo-Tag Assisted Non-Dimer System): ogon nukleotydowy, komplementarny do 3′ końca primera jest dodawany do 5′ końca primera. Ze względu na bliskie sąsiedztwo ogona 5′ następuje jego annealizacja do 3′ końca primera. W wyniku tego powstaje primer o kształcie pętli łodygowej, który wyklucza annealing obejmujący krótsze nakładki, ale pozwala na annealing primera do jego w pełni komplementarnej sekwencji w celu.
Primery chimeryczne: niektóre zasady DNA w primerze są zastąpione zasadami RNA, tworząc sekwencję chimeryczną. Temperatura topnienia sekwencji chimerycznej z inną sekwencją chimeryczną jest niższa niż sekwencji chimerycznej z DNA. Ta różnica umożliwia ustawienie temperatury annealingu w taki sposób, że primer będzie anneal do swojej sekwencji docelowej, ale nie do innych primerów chimerycznych.
Blocked-cleavable primers: metoda znana jako RNase H-dependent PCR (rhPCR), wykorzystuje termostabilną RNase HII do usuwania grupy blokującej z primerów PCR w wysokiej temperaturze. Enzym RNase HII nie wykazuje prawie żadnej aktywności w niskiej temperaturze, co sprawia, że usunięcie bloku następuje dopiero w wysokiej temperaturze. Enzym ten posiada również wrodzoną dyskryminację niedopasowania primer:template, co skutkuje dodatkową selekcją przeciwko primer-dimerom.
Zapobieganie pozyskiwaniu sygnału z dimerów primerówEdit
Podczas gdy powyższe metody mają na celu ograniczenie tworzenia PD, inne podejście ma na celu zminimalizowanie sygnału generowanego z PD w ilościowym PCR. To podejście jest użyteczne tak długo, jak długo tworzy się niewiele PD, a ich hamujący wpływ na akumulację produktu jest niewielki.
Czteroetapowa PCR: stosowana podczas pracy z niespecyficznymi barwnikami, takimi jak SYBR Green I. Opiera się na różnej długości, a co za tym idzie, różnej temperaturze topnienia PD i sekwencji docelowej. W tej metodzie sygnał jest pozyskiwany poniżej temperatury topnienia sekwencji docelowej, ale powyżej temperatury topnienia PDs.
Sondy specyficzne dla sekwencji: Sondy TaqMan i sondy typu molecular beacon generują sygnał tylko w obecności ich docelowej (komplementarnej) sekwencji, a ta zwiększona specyficzność wyklucza akwizycję sygnału (ale nie ewentualne efekty hamujące akumulację produktu) z PDs.
.